BL21 Star (DE3) pLysS；Rosetta (DE3)；BL21 (DE3)；表达感受态细胞；pET表达载体；IPTG诱导；非毒性蛋白表达；

产品组分：

菌株描述

BL21 Star (DE3) pLysS菌株来源于BL21(DE3)菌株。DE3命名表明该菌株染色体上整合λ噬菌体DE3溶原体（其上携带lacUV5启动子调控的T7 RNA聚合酶基因），IPTG用来诱导T7 RNA聚合酶的表达。该菌株含突变的rne基因（rne131），编码合成截短的RNase E，此酶丧失mRNA水解能力从而提高mRNA转录体的稳定性并增加异源蛋白产量。作为大肠杆菌B/r菌株，不含有lon蛋白酶和缺乏外膜蛋白酶OmpT，降低了外源蛋白的降解。

BL21 Star (DE3) pLysS菌株携带pLys质粒，具有氯霉素抗性（CamR）。含有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够作用于大肠杆菌细胞壁上的肽聚糖溶解大肠杆菌，从而能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。pLys质粒还含有p15A复制起始子，这一起始子使其兼容于pUC或pBR322来源的质粒。

BL21 Star (DE3) pLysS菌株特别设计适用于高拷贝、T7启动子表达载体（比如pRSET T7载体）的非毒性蛋白的高水平表达。与BL21菌株相比，BL21 Star菌株由于提高的mRNA稳定性，呈现出更高的异源基因基础表达，因此不适合毒性蛋白表达。然而，BL21 Star (DE3) pLysS菌株比BL21 Star菌株表达更低。

BL21 Star (DE3) pLysS菌株基因型：F-ompThsdSB(rB-mB-)galdcm rne131(DE3) pLysS (CamR)

产品描述

本品是大肠杆菌BL21 Star (DE3) pLysS菌株经特殊工艺制作所得的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。经pUC19质粒检测转化效率可达107 cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存几个月转化效率不发生改变。

保存与运输条件

保存：-80℃保存，六个月有效。

运输：干冰运输。

注意事项

1）   感受态细胞必须用干冰运输。感受态细胞应在-80℃保存，不可反复冻融且放置时间过长，否则会减低感受态细胞的转化效率。

2）   最好在冰上融化感受态细胞。

3）   进行转化操作时，需在相应温度及无菌条件下进行。

4）   为防止转化实验不成功，可保留部分连接反应液以重新转化，将损失降到最低。

5）   产品包装内含质粒pUC19 DNA(10pg/μl)，供对照实验用。

6）   BL21 Star (DE3) pLysS菌株携带pLysS质粒，除复苏培养基不含抗生素之外，其他所用培养基、培养液都应含有氯霉素（34μg/ml），以防止质粒丢失。

7）   为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在无菌条件的标准下进行】

1）  从-80℃冰箱取出取感受态细胞，迅速置于冰浴中，5min后待菌块融化，加入目的DNA，用手轻弹管底轻轻混匀，冰浴静置25min。

2）   42℃热激45s，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3min。此过程不要摇动离心管。

3）   向每个离心管中加700 μl无菌的SOC或LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃ 摇床，200 rpm振荡培养60min，目的使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

4）   低速离心收菌（比如4000rpm，2min），留取100μl左右上清，用枪轻轻吹打重悬菌块，之后加到含氯霉素（34μg/ml）以及所选质粒筛选抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于室温（或37℃）直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12-16h。

【注意】：

a）涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可不用离心，直接取少量转化产物涂布平板；反之，若转化的DNA总量较少，则通过离心（4,000 rpm，2min）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。

b）新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。

c）涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

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菌株描述

BL21 Star (DE3) 菌株来源于BL21(DE3)菌株，DE3命名表明该菌株染色体上整合λ噬菌体DE3溶原体（其上携带lacUV5启动子调控的T7 RNA聚合酶基因），IPTG用来诱导T7 RNA聚合酶的表达。该菌株携带一突变的rne基因（rne131），编码合成截短的RNase E，此酶丧失mRNA降解能力从而提高mRNA转录体的稳定性和增加蛋白产量。另外，BL21 Star (DE3)是大肠杆菌B/r菌株，缺乏lon和外膜蛋白酶OmpT，降低外源重组蛋白的被降解，进一步增加了蛋白表达率。BL21 Star (DE3) 菌株特别设计适用于低拷贝，T7启动子表达载体的非毒性蛋白的高水平表达。与BL21菌株相比， mRNA稳定性提高，BL21 Star菌株由于提高的mRNA稳定性，呈现出更高的异源基因基础表达，因此不适合毒性蛋白表达。

BL21 Star (DE3) 菌株基因型：F-ompThsdSB(rB-mB-)galdcm rne131(DE3)

产品描述

本品是大肠杆菌BL21 Star (DE3)菌株经特殊工艺制作所得的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。经pUC19质粒检测转化效率可达108 cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存几个月转化效率不发生改变。

保存与运输条件：

保存：-80℃保存，六个月有效。

运输：干冰运输。

注意事项

1）   感受态细胞必须用干冰运输。感受态细胞应在-80℃保存，不可反复冻融且放置时间过长，否则会减低感受态细胞的转化效率。

2）   最好在冰上融化感受态细胞。

3）   进行转化操作时，需在相应温度及无菌条件下进行。

4）   为防止转化实验不成功，可保留部分连接反应液以重新转化，将损失降到最低。

5）   产品包装内含质粒pUC19 DNA(10pg/μl)，供对照实验用。

6）   为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在无菌条件的标准下进行】

1）   取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管内，置于冰浴中。【注意：一次转化感受态细胞的建议用量为50-100 μl，可以根据实际情况分装使用。需注意所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。】

以下实验以100 μl感受态细胞为例。

2）   向感受态细胞悬液中加入目的DNA（根据实际情况加入适量的DNA，通常100 μl感受态细胞能够被1 ng超螺旋质粒DNA所饱和），用移液器轻轻吹打混匀（或用手轻弹管轻轻混匀），冰浴静置30min。

3）   42℃热激45s，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3min。此过程不要摇动离心管。

4）   向每个离心管中加700 μl无菌的SOC或LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃ 摇床，200 rpm振荡培养60min，目的使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

5）   根据实验需求，取适量已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于室温（或37℃）直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12-16h。

【注意】：

a）涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可取少量转化产物涂布平板；反之，若转化的DNA总量较少，可取200-300 μl转化产物涂布平板。若预计的克隆较少，可通过离心（4,000 rpm，2min）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。

b）新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。c）涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

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BL21 Star (DE3) 菌株基因型：F-ompThsdSB(rB-mB-)galdcm rne131(DE3)

产品描述

本品是大肠杆菌BL21 Star (DE3)菌株经特殊工艺制作所得的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。经pUC19质粒检测转化效率可达108 cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存几个月转化效率不发生改变。

保存与运输条件：

保存：-80℃保存，六个月有效。

运输：干冰运输。

注意事项

1）   感受态细胞必须用干冰运输。感受态细胞应在-80℃保存，不可反复冻融且放置时间过长，否则会减低感受态细胞的转化效率。

2）   最好在冰上融化感受态细胞。

3）   进行转化操作时，需在相应温度及无菌条件下进行。

4）   为防止转化实验不成功，可保留部分连接反应液以重新转化，将损失降到最低。

5）   产品包装内含质粒pUC19 DNA(10pg/μl)，供对照实验用。

6）   为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在无菌条件的标准下进行】

1）   取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管内，置于冰浴中。【注意：一次转化感受态细胞的建议用量为50-100 μl，可以根据实际情况分装使用。需注意所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。】

以下实验以100 μl感受态细胞为例。

2）   向感受态细胞悬液中加入目的DNA（根据实际情况加入适量的DNA，通常100 μl感受态细胞能够被1 ng超螺旋质粒DNA所饱和），用移液器轻轻吹打混匀（或用手轻弹管轻轻混匀），冰浴静置30min。

3）   42℃热激45s，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3min。此过程不要摇动离心管。

4）   向每个离心管中加700 μl无菌的SOC或LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃ 摇床，200 rpm振荡培养60min，目的使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

5）   根据实验需求，取适量已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于室温（或37℃）直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12-16h。

【注意】：

a）涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可取少量转化产物涂布平板；反之，若转化的DNA总量较少，可取200-300 μl转化产物涂布平板。若预计的克隆较少，可通过离心（4,000 rpm，2min）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。

b）新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。c）涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

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