SYTO 9；PI 碘化丙啶；Propidium Monoazide (PMA) 叠氮溴化丙锭；SYTO 9/PI Live/Dead Bacterial Double Stain Kit 活细菌/死细菌双染试剂盒；活死细菌染色；

温馨提示1）：若需做双染，可配合购买我司的碘化丙啶PI（MX4205-10MG，MX4205-1ML）。

温馨提示2）：若需做双染，亦可直接购买我司的SYTO 9/PI Live/Dead Bacterial Double Stain Kit 活细菌/死细菌双染试剂盒（MX4234-40T）。

产品描述

SYTO 9绿色荧光核酸染料（SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain），是一款优秀的绿色荧光细胞核和染色体复染剂，能渗透进入原核和真核细胞膜。SYTO 9高亲和结合DNA（以及RNA），一旦结合后呈现明显增强的荧光信号，最大激发和发射波长分别是483nm和503nm。SYTO 9极其适合用作细菌实验的核复染剂，因其对革兰氏阳性菌和阴性菌的活细胞和死细胞都能染色。SYTO 9常常与碘化丙啶（PI）联合使用，用于活/死细菌染色。

本品以DMSO储存液形式提供，浓度为5mM。只需用合适的生理缓冲液稀释到工作浓度进行简单孵育即可。适用于哺乳动物细胞、革兰氏阳性和革兰氏阴性菌。

产品特性

1） 同义名：SYTO 9 Green dye；SYTO 9绿色荧光染料；

2） 外观：橙色溶液

3） 荧光特征：E_X/E_m=485/498nm（与DNA结合）；E_X/E_m=486/501nm（与RNA结合）

图1. SYTOX 9与核酸结合的光谱特征。A）与DNA结合的吸收光谱；B）与RNA结合的吸收光谱；C）与DNA或RNA结合后的荧光发射光谱。

4） 渗透性：细胞通透性

保存与运输方法

保存：-20℃避光保存，至少1年有效。

运输：冰袋运输。

注意事项

1）荧光探针均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2) 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作

将低温保存的PMA粉末置于室温回温至少20min，低速离心使粉末沉至管底。避光条件下加入98μl无菌水，充分溶解混匀，即得到20mM储存液。储存液根据单次用量分装，-20℃避光冻存，至少6个月有效。

应用示例（来自文献，仅作参考）

Ref 1）Yagüe P, Manteca A, Simon A, Diaz-Garcia ME, Sanchez J. New method for monitoring programmed cell death and differentiation in submerged Streptomyces cultures. Appl Environ Microbiol. 2010;76(10):3401-3404. doi:10.1128/AEM.00120-10

实验目的：建立一种简单和可靠得方法来监测和定量链霉素发酵物的细胞死亡过程，使用活细胞染料SYTO 9和碘化丙啶PI。使用原理在于：SYTO 9是一种细胞膜渗透性的核酸染料，能够标记所有细胞：具膜完整性和受损的细胞膜。PI只能渗透进入膜不完整的细菌。因此，在混合细菌群内，具完整细胞膜的细菌呈绿色荧光，而破损膜结构的细菌呈红色；

Fig. S. coelicolor growth curve and antibiotic (actinorhodin and undecylprodigiosin) production in submerged cultures. Confocal microscope images of key developmental stages stained with SYTO 9 and PI are shown at the top: individual hyphae of the first compartmentalized mycelium (MI; arrows indicate septation), second multinucleated mycelium hyphae (MII), and the mycelial pellet (240 μm in diameter) undergoing PCD processes in the center (red). The transitory growth arrest phase coinciding with PCD is indicated. See text for details.

Ref 2）Robertson J, McGoverin C, Vanholsbeeck F and Swift S (2019) Optimisation of the Protocol for the LIVE/DEAD^® BacLight^TM Bacterial Viability Kit for Rapid Determination of Bacterial Load. Front. Microbiol. 10:801. doi: 10.3389/fmicb.2019.00801

实验方法（SYTO 9+PI染色）：用棕色离心管稀释SYTO 9和PI使其浓度分别为33.4和400 μM，置于冰上保存。分别加50 μl SYTO 9和50 μl PI工作液和/或0.85%生理盐水（总体积为100μl）到0.9ml培养物内，使得SYTO 9和PI 的浓度分别为1.67和20 μM。对于基本培养基的优化实验，每一组活细胞和死细胞悬液分别用SYTO 9, PI和SYTO 9+PI染色。

Fig. Live/dead spectrometry on live and dead E. coli suspensions in minimal media and saline. SYTO 9 intensity in minimal media (A), PI intensity in minimal media (B), proportion of live cells in minimal media derived from the kit ratio (C), % live cells in minimal media derived from the adjusted dye ratio (D), the proportion of live cells in saline derived from the kit ratio (E) and % live cells in saline derived from the adjusted dye ratio (F) for live and dead E. coli suspensions derived from integrating at three different wavelength ranges for each dye. An R²-value was generated from a linear regression analysis of data from each wavelength range. Data presented is the median with the range from six biological replicates.

染色流程

基于实验室经验和发表方法，建议使用广谱的染色浓度来开展使用，并且根据自身的细胞类型和实验体系来优化摸索出最佳的工作浓度（见表2）。

使用塑料管来稀释SYTO 9染料，由于稀释后的染料会粘附到玻璃上。总的来说，用不含磷酸盐的缓冲液来染色能得到最好的结果。塑料或玻璃器皿上残留的去污剂也有可能影响许多细胞或有机体的真实染色，导致在含或不含细胞的溶液中都能看到发明亮荧光的材料。确保用温和去污剂来清洗玻璃器皿，用热自来水完全冲洗干净，最后用去离子水清洗数次。

①离心收集细胞，用生理盐溶液或水重悬细胞。贴壁细胞（比如：哺乳动物细胞）可能在盖玻片上原位染色。使用表2内建议的工作浓度进行染色。初次实验，建议在建议浓度范围内做多个染料浓度，以确定能得到最佳染色的工作浓度。需要注意：生长培养基、细胞密度、是否存在其它细胞、和其它因素都可能影响染色。

②染色的真核细胞通常显示出弥散的细胞浆染色和细胞核染色，特别是经常看到明亮的核内小体染色。由于此染料具细胞膜渗透性，且中性pH下带净正电荷，也有可能染线粒体。活酵母菌内主要是线粒体染色。

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