细胞核/细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种高效的细胞裂解和抽提方法,可在90分钟内对培养细胞或新鲜组织完成细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。试剂盒兼容性好,抽提得到的蛋白适合多种下游应用,包括免疫印迹(Western Blot)、凝胶迁移分析(EMSA)、蛋白分析、报告基因检测和酶活力分析。
本试剂盒使用基于试剂的分离方案:先用细胞浆蛋白抽提试剂,在低渗透压下使细胞充分膨胀,然后破坏细胞膜,促使胞浆蛋白释放;然后通过离心得到细胞核沉淀,再用高盐的细胞核蛋白抽提试剂得到核蛋白。一般情况下,细胞浆蛋白与核蛋白之间的交叉污染约10%左右,gDNA/mRNA的干扰均降到最低水平。
本试剂盒适用于培养细胞和新鲜组织细胞核/细胞浆蛋白的抽提。按照每个细胞样本(湿体积为50μl)和每个组织样本(重量50mg)来换算,试剂盒(MP1551-60T)可以抽提60个样本,试剂盒(MP1551-120T)可以抽提120个样本。本试剂盒不适合冻存组织的蛋白抽提。
产品组分
组分编号 | 组分名称 | 货号(规格) | |
MP1551-60T | MP1551-120T | ||
A | Cytoplasmic Extraction Reagent A 细胞浆蛋白抽提试剂A | 30ml | 2×30ml |
B | Cytoplasmic Extraction Reagent B 细胞浆蛋白抽提试剂B | 1.5ml | 2×1.5ml |
C | Nuclear Extraction Reagent C 细胞核蛋白抽提试剂C | 15ml | 2×15ml |
保存与运输方法
保存:2-8℃冻存,1年稳定。
运输:冰袋运输。
注意事项
1) 建议使用广谱蛋白酶抑制剂混合物(比如:MP1610-1ML)或广谱磷酸酶抑制剂混合物(比如:MP1612-1ML)来维持提取蛋白的完整性,也可使用单一蛋白抑制剂比如:PMSF(MP1601-1ML),需根据实际的研究目的来加。
2) 抽提蛋白的所有步骤需在冰上或4℃进行。
3) 本试剂盒仅适合新鲜组织,对冻存组织的抽提效果非常差。
4) 本试剂盒抽提得到的细胞浆蛋白/细胞核蛋白都可用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行浓度测定,但不适合Bradford蛋白浓度测定试剂盒。
5) 如果需要更浓缩更高浓度的核蛋白,提取过程中加入的胞核蛋白提取试剂C的体积可以降低2~4倍,此步不会对蛋白回收产生不利影响。
6) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
- 试剂准备
从冰箱取出细胞浆蛋白抽提试剂A、B和细胞核蛋白抽提试剂C,使用前根据需要加入酶抑制剂。
- 培养细胞的蛋白抽提
2.1 对于贴壁细胞:用细胞刮子刮下细胞,或用EDTA溶液处理细胞使得细胞贴壁不再很紧,并用移液器吹打细胞。600×g离心5min收集细胞,尽量吸尽上清,留下细胞沉淀备用。
【注意】:尽量避免用胰酶消化细胞,以免胰酶降解抽提的目的蛋白。
2.2 对于悬浮细胞:600×g离心5min收集细胞,尽量吸尽上清,留下细胞沉淀备用。
2.3 加入适量预冷的PBS重悬细胞,600×g离心5min收集细胞,尽量吸尽上清,留下细胞沉淀备用。
2.4 按照下表加入各试剂的量(规格:μl):
细胞湿体积 | 细胞浆蛋白抽提试剂A | 细胞浆蛋白抽提试剂B | 细胞核蛋白抽提试剂C |
10 | 100 | 5 | 50 |
20 | 200 | 10 | 100 |
50 | 500 | 25 | 250 |
100 | 1000 | 50 | 500 |
2.5 加入细胞浆蛋白抽提试剂A,振荡混匀数秒,使细胞完全悬浮并分散开,放置在冰上孵育10~15min。
2.6 加入细胞浆蛋白提取试剂B,振荡混匀5s,冰上孵育1min。
【注意】:若胞核蛋白中掺杂胞浆蛋白,可适当延长此步的孵育时间,一般可以延长1~5min。
2.7 振荡混匀5s,16000×g离心5min。
2.8 立即吸取上清至一个预冷的离心管中,即为抽提得到的细胞浆蛋白,或置于冰上保存立即用于后续实验,或置于-80℃保存用于后续实验。
【注意】:此步千万不要触及沉淀,可以在沉淀上方保留极小体积的上清,以免触及沉淀。
2.9 对于沉淀,完全吸尽残余上清【注意:此处需完全吸尽上清,否则会引入细胞浆蛋白的污染】。加入细胞核蛋白提取试剂C,振荡混匀数秒,使沉淀完全悬浮并分散开,放回冰浴中孵育40min,期间每隔10min拿出来振荡混匀15s,16000×g离心5min。
2.10 立即吸取上清至一个预冷的离心管中,即为抽提得到的细胞核蛋白,或置于冰上保存立即用于后续实验,或置于-80℃保存用于后续实验。
- 新鲜组织的蛋白抽提
3.1 手术切除组织块,迅速置于预冷的PBS中,漂洗数次,滤纸吸干水分。将组织尽量切成非常细小的碎片,称重取适量组织,按照下表加入各试剂的量(规格:μl):
组织重量(mg) | 细胞浆蛋白抽提试剂A | 细胞浆蛋白抽提试剂B | 细胞核蛋白抽提试剂C |
20 | 200 | 10 | 100 |
50 | 500 | 25 | 250 |
80 | 800 | 40 | 400 |
100 | 1000 | 50 | 500 |
3.2 加入细胞浆蛋白抽提试剂A,在匀浆器内匀浆,冰上操作,直至获得均匀的悬浮液。匀浆后将匀浆液转移至一个预冷的离心管内,冰浴放置10~15min。
3.3 加入细胞浆蛋白抽提试剂B,振荡混匀5s,冰上孵育1min。
3.4 振荡混匀5s,16000×g离心5min。
3.5 立即吸取上清至一个预冷的离心管中,即为抽提得到的细胞浆蛋白,或置于冰上保存立即用于后续实验,或置于-80℃保存用于后续实验。
【注意】:此步千万不要触及沉淀,可以在沉淀上方保留极小体积的上清,以免触及沉淀。
3.6 对于沉淀,完全吸尽残余上清【注意:此处需完全吸尽上清,否则会引入细胞浆蛋白的污染】。加入细胞核蛋白提取试剂C,振荡混匀数秒,使沉淀完全悬浮并分散开,放回冰浴中孵育40min,期间每隔10min拿出来振荡混匀15s,16000×g离心5min。
3.7 立即吸取上清至一个预冷的离心管中,即为抽提得到的细胞核蛋白,或置于冰上保存立即用于后续实验,或置于-80℃保存用于后续实验。
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名称 | 规格 | |
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可能遇到的问题解答
常见问题 | 引起原因 | 解决方法 |
提取的细胞浆蛋白量少 | 细胞没裂解完全 | 增加胞浆蛋白抽提试剂的量 |
细胞没完全分散开 | 剧烈震荡完全混匀细胞 | |
组织没充分匀浆 | 匀浆充分 | |
提取的细胞核蛋白量少 | 细胞核沉淀没分散开 | 剧烈震荡完全混匀细胞核沉淀 |
细胞核量少 | 增加离心时间 | |
蛋白活性低或没有活性 | 样品没低温保存 | 低温处理样品 |
样品中蛋白酶的存在 | 加入酶抑制剂 | |
细胞浆与核蛋白交叉 | 细胞浆蛋白裂解时间过长 | 减少加入细胞浆蛋白抽提试剂A和 B 后的孵育时间 |
细胞浆蛋白溶液没有完全吸干净 | 小心吸干净细胞浆蛋白溶液 | |
取上清时吸入少量的胞核沉淀 | 小心吸干净细胞浆蛋白溶液 |