Rosetta-gami;Rosetta (DE3);Origami;表达感受态细胞;pET表达载体;IPTG诱导;毒性蛋白表达;
产品订购:
货号 | 产品名称 | 规格 | |
MF2341-1000UL | Rosetta-gami(DE3)pLysS Chemically Competent Cell | 10×100μl | |
MF2341-5000UL | Rosetta-gami(DE3)pLysS Chemically Competent Cell | 50×100μl |
产品组分:
组分编号 | 组分名 |
货号(规格) |
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MF2341-1000UL | MF2341-5000UL | ||
MF2341-A | Rosetta-gami(DE3)pLysS Competent Cell | 10×100μl | 50×100μl |
MF2341-B | Control Plasmid puC19, 10pg/μl | 10μl | 10μl |
菌株描述
Rosetta-gami菌株为Origami衍生菌,含突变的硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin Reductase, trxB)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, gor)基因,明显改善细胞质内二硫键的形成,增强蛋白的可溶性。该菌株补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子(AGG,AGA,AUA,CUA,CCC,GGA)对应的tRNA,位于一共存的氯霉素抗性质粒上,由天然启动子启动tRNA,提高了外源基因的表达水平。
DE3命名表明该菌株染色体上整合λ噬菌体DE3溶原体(携带lacUV5启动子调控的T7 RNA聚合酶基因)。这种菌株适用于目的基因克隆在pET载体上的蛋白生产,由IPTG诱导表达。
pLysS含有表达T7溶菌酶的基因,T7溶菌酶能够作用于大肠杆菌细胞壁上的肽聚糖溶解大肠杆菌,从而能够降低目的基因的背景表达水平,但不干扰IPTG诱导的表达。适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。Rosetta-gami(DE3)pLysS菌株具有卡那霉素,氯霉素,链霉素和四环素抗性,为亮氨酸生长缺陷型菌株。
Rosetta-gami(DE3)pLysS菌株基因型:Δ(ara-leu)7697 ΔlacX74 ΔphoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL(DE3) F´[lac+lacIqpro] gor522::Tn10 trxB::kan pLysSRARE2 (CamR, StrR, TetR)
产品描述
本品是大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)pLysS菌株经特殊工艺制作所得的感受态细胞,可用于DNA的热击转化。经pUC19质粒检测转化效率可达108 cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存几个月转化效率不发生改变。
保存与运输方法
保存:-80℃保存,六个月有效。
运输:干冰运输。
注意事项
1) 感受态细胞必须用干冰运输。感受态细胞应在-80℃保存,不可反复冻融且放置时间过长,否则会减低感受态细胞的转化效率。
2) 最好在冰上融化感受态细胞。
3) 进行转化操作时,需在相应温度及无菌条件下进行。
4) 为防止转化实验不成功,可保留部分连接反应液以重新转化,将损失降到最低。
5) 产品包装内含质粒pUC19 DNA(10pg/μl),供对照实验用。
6) Rosetta-gami(DE3)pLysS菌株携带pLysS质粒,除复苏培养基不含抗生素之外,其他所用培养基、培养液都应含有氯霉素(34μg/ml),以防止质粒丢失。
7) Rosetta-gami(DE3)pLysS菌株具有卡那霉素抗性,不能用于具此抗性质粒的表达。
8) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法【所有操作均在无菌条件的标准下进行】
1) 从-80℃冰箱取出取感受态细胞,迅速置于冰浴中,5min后待菌块融化,加入目的DNA,用手轻弹管底轻轻混匀,冰浴静置25min。
2) 42℃水浴热激45s,迅速将离心管转移到冰浴中,冰上静置2-3min。此过程不要摇动离心管。
3) 向每个离心管中加700 μl无菌的SOC或LB培养基(不含抗生素),混匀后置于37℃ 摇床,200 rpm振荡培养60min,目的使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。
4) 低速离心收菌(比如4000rpm,2min),留取100μl左右上清,用枪轻轻吹打重悬菌块,之后加到含氯霉素(34μg/ml)以及所选质粒筛选抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上,用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开,将平板置于室温(或37℃)直至液体被吸收,倒置培养,37℃培养12-16h。
【注意】:
a)涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多,可不用离心,直接取少量转化产物涂布平板;反之,若转化的DNA总量较少,则通过离心(4,000 rpm,2min)后吸除部分培养液,悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。
b)新制备的固体培养基不易涂干,可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。
c)涂布剩余的菌液可置于4℃保存,如果次日的转化菌落数过少,可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。
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