Fluo-8 AM, Cell Permeant 钙离子荧光探针；Fluo-2, AM；Fluo-2 Medium Affinity,Acetoxymethyl Ester；Fluo-3；Fluo-4；HTS Screen Assay 高通量筛选；

订购信息：

产品描述

Fluo-8，是目前最亮的可见光激发波长Ca2+荧光探针，其荧光强度比Fluo-4强两倍，比Fluo-3强四倍。Fluo-8具中等程度的Ca2+亲和力，几乎接近Fluo-3，Fluo-4（Fluo-3: Kd=0.4μM、Fluo-4: Kd=0.36μM、Fluo-4: Kd= 0.389μM），使用上几乎同Fluo-3和Fluo-4。

Fluo-8不仅维持Fluo-3，Fluo-4便捷的光谱检测特性，与Ca2+结合后的最大激发波长为490nm，最大发射波长为514nm。而且具有改善的细胞载入和Ca2+响应能力。Fluo-8加载具较弱的温度依赖性，在室温或37℃孵育皆染色良好，不像Fluo-3，Fluo-4严格要求在37℃孵育，此特征使其更适用于HTS高通量筛选实验。Fluo-8应用广泛，与许多细胞系和靶向样本兼容，不会受配体或靶标本身信号干扰。Fluo-8可通过激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光显微镜等来检测胞内钙离子水平的变化。

Fluo-8, AM是Fluo-8的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内，即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Fluo-8，从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。本品以50μg小包装的冻干粉形式供货，用于细胞内Ca2+水平检测时，常用浓度为1-5μM。

基本特性：

1） 同义名：Fluo-8, Acetoxymethyl Ester;Fluo-2, AM; Fluo-2 Medium Affinity, Acetoxymethyl Ester;

2） 化学名：Bis(acetoxymethyl) 2,2′-((4-(6-(acetoxymethoxy)-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)-2-(2-(bis(2-acetoxymethoxy)-2-oxoethyl)amino)phenoxy)ethoxy)phenyl)azanediyl)diacetate

3） 分子式：C50H50N2O23

4） 分子量：1046.93

5） 最大激发/发射波长：490/514 nm（Ca2+结合）

6） 溶解性：溶于DMSO（1~5mM）

7） 化学结构式：

保存与运输方法

保存：-20℃干燥避光保存，有效期一年。

运输：室温运输。

注意事项

1）荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2）乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。

3）Fluo-8, AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可在20-25℃温育片刻至全部融解后使用。

4）Fluo-8, AM第一次使用，建议储存液现配现用，分装成单次用量，严格做到≤-20℃密封干燥冻存，以防止受潮。为了保证良好的实验效果，尽量在短时间内使用。

5）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

【注意】以下使用方法仅用作参考，可根据具体的实验条件做出调整。

A、试剂准备

1. 配制Pluronic F-127母液：称取100mg Pluronic F-127粉末（货号：MS4301-100MG）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。

2. HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3)或者其他生理缓冲液

B，操作步骤

1. 用无水DMSO溶解Fluo-8, AM配制成1-5mM的储存液，或将已配好的Fluo-8, AM储存液取出于室温回温。（如：若配制成4mM的母液，需向50µg Fluo-8,AM中加入11.9µl无水DMSO）。

2. 用HHBS或其他生理缓冲液将Fluo-8, AM+DMSO储存液稀释到1-10µM的工作液，提前加入适量的20% Pluronic F-127溶液，使其终浓度为0.02%。

【注①】：Fluo-8, AM应用在大部分细胞的推荐加载浓度为4-5µM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。

【注②】：Fluo-8, AM工作液需现配现用，避免反复冻存。

【注③】：Pluronic F-127可以防止Fluo-8, AM在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但Pluronic F-127可降低Fluo-8, AM的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议加入储存液长期保存。

3.【可选】如果细胞内含有机阴离子转运体，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入细胞培养基内，以降低去酯化探针的泄露水平。

【注①】：丙磺舒或磺吡酮储存液相当偏碱，因此加入培养基后需要重新调整pH。

4. 将准备好的Fluo-8, AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。37℃或者室温孵育20-60min。

【注①】：关于孵育的时间，如果首次做实验不能确定，建议先孵育30min，看荧光效果；如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。

【注②】：降低探针加载温度可能会降低探针的区室化现象。

5. 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理缓冲液（如有必要，使用含转运体抑制剂如2.5mM丙磺酸的缓冲液）替换，以去除多余探针。

6. 用适当的仪器如激光共聚焦、流式细胞仪、荧光酶标仪，以及波长Ex/Em=490/520 nm来进行检测。

【注①】：Fluo-8, AM进入胞内后，经酯酶降解形成Fluo-8，并不是以共价结合的形式滞留在细胞质内。因此不可对加载染料的活细胞进行固定处理，再进行Ca2+水平检测。

描述

Fluo-8 Sodium Salt, Cell Impermeant 钙离子荧光探针

搜索关键词：

Fluo-8 salt；Fluo-8, AM；Fluo-4, AM；Rhod-2 AM；Rhod-4 AM；Fura-2 AM；可见光激发波长Ca2+荧光探针；

产品信息：

基本介绍：

Fluo-8，是目前最亮的可见光激发波长Ca2+荧光探针，其荧光强度比Fluo-4强两倍，比Fluo-3强四倍。Fluo-8具中等程度的Ca2+亲和力，几乎接近Fluo-3，Fluo-4（Fluo-3: Kd=0.4μM、Fluo-4: Kd=0.36μM、Fluo-4: Kd= 0.389μM），使用上几乎同Fluo-3和Fluo-4。Fluo-8不仅维持Fluo-3，Fluo-4便捷的光谱检测特性，与Ca2+结合后的最大激发波长为490nm，最大发射波长为514nm。而且具有改善的细胞载入和Ca2+响应能力。Fluo-8加载具较弱的温度依赖性，在室温或37℃孵育皆染色良好，不像Fluo-3，Fluo-4严格要求在37℃孵育，此特征使其更适用于HTS高通量筛选实验。Fluo-8应用广泛，与许多细胞系和靶向样本兼容，不会受配体或靶标本身信号干扰。Fluo-8可通过激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光显微镜等来检测胞内钙离子水平的变化。

Fluo-8 Sodium Salt是钠盐形式的Fluo-8，不具有细胞膜渗透性，溶于水。可通过微注射、膜片电极、划痕标记等方式加载进入细胞，从而检测胞内钙离子水平。

产品特性

保存与运输方法

保存：-20℃干燥避光保存，有效期至少1年。

运输：冰袋运输。

注意事项

1）   荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2）   基于BAPTA结构的钙离子指示剂比如Fluo-3，Fluo-4，能够结合很多重金属阳离子（比如：Mn2+、Zn2+、Pb2+）且实质上亲和力高于Ca2+。因此，由于这些重金属离子存在对钙测定的干扰可使用重金属螯合剂-TPEN（MX4529-25MG）来控制。

3）   为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

相关产品

描述

具细胞膜渗透性的Mag-Fluo-4 AM是Fluo-4 AM（货号：MX4504-50UG）的一种结构类似物，对镁离子（Mg2+）和钙离子（Ca2+）的Kd值分别是4.7mM和22µM，是一种非常有用的细胞内镁离子指示剂和低亲和性钙离子指示剂。

产品特征

1）镁离子指示探针

Mag-Fluo-4与Thermo（invitrogen）公司的Magnesium Green indicator相比，具更加灵敏的Mg2+荧光反应。由于细胞内Mg2+的生理波动幅度通常很小，这一点点灵敏度的提高都是值得考虑的优势。与Fluo-4一样，Mag-Fluo-4在不含二价阳离子的情况下基本无荧光，一旦与Mg2+结合后，呈明显的荧光加强，但无光谱迁移（见下图）。

图. Mag-Fluo-4在0-50mM Mg2+溶液内的荧光发射光谱

2）钙离子指示探针

Mag-Fluo-4是Fluo-4的类似物，具有更低钙离子结合亲和性，特别适合用于检测1 µM~1 mM范围内的胞内钙离子水平。

产品特性

1） 同义名：Mag-Fluo-4acetoxymethyl ester,cell permeant

2） 分子式：C37H33F2NO18

3） 分子量：817.65g/mol

4） 外观：橙色固体

5） 纯度：≥90%

6） Ex/Em：494/516 nm

7） 溶解性：溶于DMSO

8） 化学结构式：

保存与运输方法

保存：-20ºC干燥避光保存，至少一年有效。

运输：冰袋运输。

 注意事项

1）荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1.储存液制备

取一管低温保存的Mag-Fluo-4 AM，置于室温回温至少20min。之后加入高质量无水DMSO配制成1~5mM储存液，比如50μgMag-Fluo-4 AM（Mw：817.65 g/mol）溶于12μl DMSO，充分溶解后，即得到5mM储存液。【注意】未使用的储存液分装储存在-20℃，避免反复冻融，且要避光保存。尽快使用完。

2.操作步骤

【注意】以下使用方法仅作参考，需根据具体的细胞类型和实验要求做出调整。加载温度范围是RT~37℃，更高温度会提高加载速度，但更低温度能最小化染料的内在化现象。表面活性剂Pluronic®F-127有时加入能促进AM探针在水溶性缓冲液内的均匀分散。

2.1 在所需温度（25℃~37℃）预孵育细胞10min，使其离子梯度达到稳定和平衡。

2.2 取4μl Mag-Fluo-4 AM储存液和5μl 20% Pluronic®F-127，加入1ml细胞培养液，剧烈漩涡混匀得到均匀的探针分散液。

2.3 取250μl上述制备的探针分散液加入750μl含细胞的培养基内，混匀，此时得到终浓度为1~5μM的工作液，根据起始母液浓度来确定。

2.4 根据需求探针孵育15~60min。

2.5 细胞清洗3次，之后继续孵育30min以保证细胞内的探针完全去酯化。之后选择合适的仪器，进行荧光测定。

应用示例（来自文献，仅用作参考）

文献一、Zheng JM et al. MagT1 regulated the odontogenic differentiation of BMMSCs induced byTGC-CM via ERK signaling pathway. Stem Cell Res Ther. 2019 Jan 31;10(1):48.

使用方法（细胞内镁离子水平的流式检测）：1）用生理培养液（120 mM NaCl, 20 mM HEPES, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 1.25 mM CaCl2, and 10 mM glucose）于37℃预孵育BMMSCs细胞10min使其达到离子梯度的稳定和平衡；2）用DMSO配制Mag-Fluo-4-AM储存液1mM；3）取4ul Mag-Fluo-4-AM储存液（1mM）和5ul 20% F-127，加入1ml培养基内，充分混匀；4）取0.25ml 分散液加入0.75ml含细胞培养液，使得探针终浓度为1uM；继续孵育30min，之后清洗细胞3次，之后再孵育30min保证细胞内AM基团的完全去酯化；5）之后用流式细胞仪分析荧光强度（Ex/em:480/520nm）。

Fig 1. MagT1 knockdown reduced intracellular Mg2+ level in BMMSCs. Intracellular Mg2+ level was significantly reduced in MagT1 knockdown BMMSCs measured by indicator Mag-Fluo-4-AM using flow cytometry.

文献二、Ainbinder A et al. Role of Mitofusin-2 in Mitochondrial Localization and Calcium Uptake in Skeletal Muscle. Cell Calcium. 2015 Jan;57(1):14-24.

使用方法（肌浆钙离子的mag-fluo-4光度测定）：趾短屈肌（FDB）肌肉纤维用Mag-Fluo-4-AM（4 µM）室温加载20min，之后用加含25 µM BTS的无探针溶液清洗20min。之后对纤维进行电刺激，用一系列抽搐刺激（1 ms pulse at 2 Hz）或5个连续性的强直电刺激。mag-fluo-4用480±15nm激发和535±30nm发射检测。

Fig 2. Measurement of mitochondrial Ca2+ uptake during twitch stimulation in mt-pericam expressing CTRL and Mfn2 KD FDB fibers. A. Average (±SE) traces of mt-pericam fluorescence (402 nm excitation/515 nm emission) in CTRL (black circles) and Mfn2 KD (white circles) fibers during twitch stimulation. B. Average (±SE) relative change in mt-pericam fluorescence (ΔF/F) in CTRL and Mfn2 KD FDB fibers during twitch stimulation. C. Representative mag-fluo-4 traces during twitch stimulation of CTRL (black trace) or Mfn2 KD (grey trace) FDB fibers. D. Average (±SE) relative change in myoplasmic mag-fluo-4 fluorescence during twitch stimulation of CTRL or Mfn2 KD FDB fibers.

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具细胞膜渗透性的Mag-Fluo-4 AM是Fluo-4 AM（货号：MX4504-50UG）的一种结构类似物，对镁离子（Mg2+）和钙离子（Ca2+）的Kd值分别是4.7mM和22µM，是一种非常有用的细胞内镁离子指示剂和低亲和性钙离子指示剂。

产品特征

1）镁离子指示探针

Mag-Fluo-4与Thermo（invitrogen）公司的Magnesium Green indicator相比，具更加灵敏的Mg2+荧光反应。由于细胞内Mg2+的生理波动幅度通常很小，这一点点灵敏度的提高都是值得考虑的优势。与Fluo-4一样，Mag-Fluo-4在不含二价阳离子的情况下基本无荧光，一旦与Mg2+结合后，呈明显的荧光加强，但无光谱迁移（见下图）。

图. Mag-Fluo-4在0-50mM Mg2+溶液内的荧光发射光谱

2）钙离子指示探针

Mag-Fluo-4是Fluo-4的类似物，具有更低钙离子结合亲和性，特别适合用于检测1 µM~1 mM范围内的胞内钙离子水平。

产品特性

1） 同义名：Mag-Fluo-4acetoxymethyl ester,cell permeant

2） 分子式：C37H33F2NO18

3） 分子量：817.65g/mol

4） 外观：橙色固体

5） 纯度：≥90%

6） Ex/Em：494/516 nm

7） 溶解性：溶于DMSO

8） 化学结构式：

保存与运输方法

保存：-20ºC干燥避光保存，至少一年有效。

运输：冰袋运输。

注意事项

1）荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1.储存液制备

取一管低温保存的Mag-Fluo-4 AM，置于室温回温至少20min。之后加入高质量无水DMSO配制成1~5mM储存液，比如50μgMag-Fluo-4 AM（Mw：817.65 g/mol）溶于12μl DMSO，充分溶解后，即得到5mM储存液。【注意】未使用的储存液分装储存在-20℃，避免反复冻融，且要避光保存。尽快使用完。

2.操作步骤

【注意】以下使用方法仅作参考，需根据具体的细胞类型和实验要求做出调整。加载温度范围是RT~37℃，更高温度会提高加载速度，但更低温度能最小化染料的内在化现象。表面活性剂Pluronic®F-127有时加入能促进AM探针在水溶性缓冲液内的均匀分散。

2.1 在所需温度（25℃~37℃）预孵育细胞10min，使其离子梯度达到稳定和平衡。

2.2 取4μl Mag-Fluo-4 AM储存液和5μl 20% Pluronic®F-127，加入1ml细胞培养液，剧烈漩涡混匀得到均匀的探针分散液。

2.3 取250μl上述制备的探针分散液加入750μl含细胞的培养基内，混匀，此时得到终浓度为1~5μM的工作液，根据起始母液浓度来确定。

2.4 根据需求探针孵育15~60min。

2.5 细胞清洗3次，之后继续孵育30min以保证细胞内的探针完全去酯化。之后选择合适的仪器，进行荧光测定。

应用示例（来自文献，仅用作参考）

文献一、Zheng JM et al. MagT1 regulated the odontogenic differentiation of BMMSCs induced byTGC-CM via ERK signaling pathway. Stem Cell Res Ther. 2019 Jan 31;10(1):48.

使用方法（细胞内镁离子水平的流式检测）：1）用生理培养液（120 mM NaCl, 20 mM HEPES, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 1.25 mM CaCl2, and 10 mM glucose）于37℃预孵育BMMSCs细胞10min使其达到离子梯度的稳定和平衡；2）用DMSO配制Mag-Fluo-4-AM储存液1mM；3）取4ul Mag-Fluo-4-AM储存液（1mM）和5ul 20% F-127，加入1ml培养基内，充分混匀；4）取0.25ml 分散液加入0.75ml含细胞培养液，使得探针终浓度为1uM；继续孵育30min，之后清洗细胞3次，之后再孵育30min保证细胞内AM基团的完全去酯化；5）之后用流式细胞仪分析荧光强度（Ex/em:480/520nm）。

Fig 1. MagT1 knockdown reduced intracellular Mg2+ level in BMMSCs. Intracellular Mg2+ level was significantly reduced in MagT1 knockdown BMMSCs measured by indicator Mag-Fluo-4-AM using flow cytometry.

文献二、Ainbinder A et al. Role of Mitofusin-2 in Mitochondrial Localization and Calcium Uptake in Skeletal Muscle. Cell Calcium. 2015 Jan;57(1):14-24.

使用方法（肌浆钙离子的mag-fluo-4光度测定）：趾短屈肌（FDB）肌肉纤维用Mag-Fluo-4-AM（4 µM）室温加载20min，之后用加含25 µM BTS的无探针溶液清洗20min。之后对纤维进行电刺激，用一系列抽搐刺激（1 ms pulse at 2 Hz）或5个连续性的强直电刺激。mag-fluo-4用480±15nm激发和535±30nm发射检测。

Fig 2. Measurement of mitochondrial Ca2+ uptake during twitch stimulation in mt-pericam expressing CTRL and Mfn2 KD FDB fibers. A. Average (±SE) traces of mt-pericam fluorescence (402 nm excitation/515 nm emission) in CTRL (black circles) and Mfn2 KD (white circles) fibers during twitch stimulation. B. Average (±SE) relative change in mt-pericam fluorescence (ΔF/F) in CTRL and Mfn2 KD FDB fibers during twitch stimulation. C. Representative mag-fluo-4 traces during twitch stimulation of CTRL (black trace) or Mfn2 KD (grey trace) FDB fibers. D. Average (±SE) relative change in myoplasmic mag-fluo-4 fluorescence during twitch stimulation of CTRL or Mfn2 KD FDB fibers.

相关产品

Fluo-8 AM, Cell Permeant 钙离子荧光探针；Fluo-2, AM；Fluo-2 Medium Affinity,Acetoxymethyl Ester；Fluo-3；Fluo-4；HTS Screen Assay 高通量筛选；

订购信息：

产品描述

Fluo-8，是目前最亮的可见光激发波长Ca2+荧光探针，其荧光强度比Fluo-4强两倍，比Fluo-3强四倍。Fluo-8具中等程度的Ca2+亲和力，几乎接近Fluo-3，Fluo-4（Fluo-3: Kd=0.4μM、Fluo-4: Kd=0.36μM、Fluo-4: Kd= 0.389μM），使用上几乎同Fluo-3和Fluo-4。

Fluo-8不仅维持Fluo-3，Fluo-4便捷的光谱检测特性，与Ca2+结合后的最大激发波长为490nm，最大发射波长为514nm。而且具有改善的细胞载入和Ca2+响应能力。Fluo-8加载具较弱的温度依赖性，在室温或37℃孵育皆染色良好，不像Fluo-3，Fluo-4严格要求在37℃孵育，此特征使其更适用于HTS高通量筛选实验。Fluo-8应用广泛，与许多细胞系和靶向样本兼容，不会受配体或靶标本身信号干扰。Fluo-8可通过激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光显微镜等来检测胞内钙离子水平的变化。

Fluo-8, AM是Fluo-8的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内，即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Fluo-8，从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。本品以50μg小包装的冻干粉形式供货，用于细胞内Ca2+水平检测时，常用浓度为1-5μM。

基本特性：

1） 同义名：Fluo-8, Acetoxymethyl Ester;Fluo-2, AM; Fluo-2 Medium Affinity, Acetoxymethyl Ester;

2） 化学名：Bis(acetoxymethyl) 2,2′-((4-(6-(acetoxymethoxy)-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)-2-(2-(bis(2-acetoxymethoxy)-2-oxoethyl)amino)phenoxy)ethoxy)phenyl)azanediyl)diacetate

3） 分子式：C50H50N2O23

4） 分子量：1046.93

5） 最大激发/发射波长：490/514 nm（Ca2+结合）

6） 溶解性：溶于DMSO（1~5mM）

7） 化学结构式：

保存与运输方法

保存：-20℃干燥避光保存，有效期一年。

运输：室温运输。

注意事项

1）荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2）乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。

3）Fluo-8, AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可在20-25℃温育片刻至全部融解后使用。

4）Fluo-8, AM第一次使用，建议储存液现配现用，分装成单次用量，严格做到≤-20℃密封干燥冻存，以防止受潮。为了保证良好的实验效果，尽量在短时间内使用。

5）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

【注意】以下使用方法仅用作参考，可根据具体的实验条件做出调整。

A、试剂准备

1. 配制Pluronic F-127母液：称取100mg Pluronic F-127粉末（货号：MS4301-100MG）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。

2. HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3)或者其他生理缓冲液

B，操作步骤

1. 用无水DMSO溶解Fluo-8, AM配制成1-5mM的储存液，或将已配好的Fluo-8, AM储存液取出于室温回温。（如：若配制成4mM的母液，需向50µg Fluo-8,AM中加入11.9µl无水DMSO）。

2. 用HHBS或其他生理缓冲液将Fluo-8, AM+DMSO储存液稀释到1-10µM的工作液，提前加入适量的20% Pluronic F-127溶液，使其终浓度为0.02%。

【注①】：Fluo-8, AM应用在大部分细胞的推荐加载浓度为4-5µM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。

【注②】：Fluo-8, AM工作液需现配现用，避免反复冻存。

【注③】：Pluronic F-127可以防止Fluo-8, AM在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但Pluronic F-127可降低Fluo-8, AM的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议加入储存液长期保存。

3.【可选】如果细胞内含有机阴离子转运体，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入细胞培养基内，以降低去酯化探针的泄露水平。

【注①】：丙磺舒或磺吡酮储存液相当偏碱，因此加入培养基后需要重新调整pH。

4. 将准备好的Fluo-8, AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。37℃或者室温孵育20-60min。

【注①】：关于孵育的时间，如果首次做实验不能确定，建议先孵育30min，看荧光效果；如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。

【注②】：降低探针加载温度可能会降低探针的区室化现象。

5. 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理缓冲液（如有必要，使用含转运体抑制剂如2.5mM丙磺酸的缓冲液）替换，以去除多余探针。

6. 用适当的仪器如激光共聚焦、流式细胞仪、荧光酶标仪，以及波长Ex/Em=490/520 nm来进行检测。

【注①】：Fluo-8, AM进入胞内后，经酯酶降解形成Fluo-8，并不是以共价结合的形式滞留在细胞质内。因此不可对加载染料的活细胞进行固定处理，再进行Ca2+水平检测。

Fluo-4 AM, Cell Permeant 钙离子荧光探针，超级纯；Fluo-4,Acetoxymethyl Ester; 可见光激发波长 Ca ²⁺荧光探针；Fluo-3；Fluo-8, AM；Rhod-2, AM；CAS NO：273221-67-3；

Fluo-4是可见光激发波长Ca2+荧光探针Fluo-3的改良版本，通过将Fluo-3结构上的氯离子（Cl-）替换为电子吸引力更强的氟离子（F-），使得最大激发波长往短波长偏移10nm左右。正由于这个波长更接近氩激光器的波长，则当使用氩激光器来激发探针Fluo-4，能够得到更强的荧光强度，比Fluo-3强一倍。另外，Fluo-4的Ca2+亲和力几乎接近Fluo-3（Fluo-3: Kd=0.4μM、Fluo-4: Kd=0.36μM），因此，使用上几乎同Fluo-3。Ca2+结合后的最大激发波长为494nm，最大发射波长为516nm。可通过激光共聚焦显微镜或流式细胞仪来检测胞内钙离子水平的变化。

Fluo-4, AM是Fluo-4的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内，即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Fluo-4，从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。

可见光激发Ca2+荧光探针的优势：

与紫外光激发的荧光探针相比，如Fura-2和Indo-1，可见光激发Ca2+探针具有以下特点：

1）适用于大多数的激光共聚焦测钙系统，包括共聚焦激发扫描显微镜以及流式细胞仪等。

2）具有更强的染料吸收性能，使得更低浓度的探针即可成功检测Ca2+变化，从而降低对活细胞的光毒性。

3）Ca2+依赖性荧光强度增强，对Ca2+变化水平检测敏感度更高。

4）降低样品自荧光以及光散射的干扰。

5）兼容光激活探针以及UV-激发试剂，因此更方便于多参数检测。

6）无光谱偏移。

Fluo-4, AM相比较于Fluo-3的优势：

1） 激发和发射波长往短波长偏移10nm，更接近氩激光器的波长，。因此，当使用488nm进行荧光激发，得到更强的荧光信号，比Fluo-3强一倍。

2） 50μg小包装供应，使用方便，且能很好保证产品的稳定性。

Fluo-4, AM的应用图片：

Fig. 1, U2OS cells were seeded overnight at 40,000 cells per 100 µL per well in a 96-well black wall/clear bottom costar plate. The growth medium was removed, and the cells were incubated with 100 µl of 4 µMFluo-3, AMorFluo-4, AMin HHBS at 37 °C, 5% CO2incubator for 1 hour. The cells were washed twice with 200 µl HHBS, then imaged with a fluorescence microscope using FITC channel.

相关产品【进口原料，现货或1周货期】：

Fluo-4 AM, Cell Permeant 钙离子荧光探针，超级纯；Fluo-4,Acetoxymethyl Ester; 可见光激发波长 Ca ²⁺荧光探针；Fluo-3；Fluo-8, AM；Rhod-2, AM；CAS NO：273221-67-3；

Fluo-4是可见光激发波长Ca2+荧光探针Fluo-3的改良版本，通过将Fluo-3结构上的氯离子（Cl-）替换为电子吸引力更强的氟离子（F-），使得最大激发波长往短波长偏移10nm左右。正由于这个波长更接近氩激光器的波长，则当使用氩激光器来激发探针Fluo-4，能够得到更强的荧光强度，比Fluo-3强一倍。另外，Fluo-4的Ca2+亲和力几乎接近Fluo-3（Fluo-3: Kd=0.4μM、Fluo-4: Kd=0.36μM），因此，使用上几乎同Fluo-3。Ca2+结合后的最大激发波长为494nm，最大发射波长为516nm。可通过激光共聚焦显微镜或流式细胞仪来检测胞内钙离子水平的变化。

Fluo-4, AM是Fluo-4的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内，即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Fluo-4，从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。

可见光激发Ca2+荧光探针的优势：

与紫外光激发的荧光探针相比，如Fura-2和Indo-1，可见光激发Ca2+探针具有以下特点：

1）适用于大多数的激光共聚焦测钙系统，包括共聚焦激发扫描显微镜以及流式细胞仪等。

2）具有更强的染料吸收性能，使得更低浓度的探针即可成功检测Ca2+变化，从而降低对活细胞的光毒性。

3）Ca2+依赖性荧光强度增强，对Ca2+变化水平检测敏感度更高。

4）降低样品自荧光以及光散射的干扰。

5）兼容光激活探针以及UV-激发试剂，因此更方便于多参数检测。

6）无光谱偏移。

Fluo-4, AM相比较于Fluo-3的优势：

1） 激发和发射波长往短波长偏移10nm，更接近氩激光器的波长，。因此，当使用488nm进行荧光激发，得到更强的荧光信号，比Fluo-3强一倍。

2） 50μg小包装供应，使用方便，且能很好保证产品的稳定性。

Fluo-4, AM的应用图片：

Fig. 1, U2OS cells were seeded overnight at 40,000 cells per 100 µL per well in a 96-well black wall/clear bottom costar plate. The growth medium was removed, and the cells were incubated with 100 µl of 4 µMFluo-3, AMorFluo-4, AMin HHBS at 37 °C, 5% CO2incubator for 1 hour. The cells were washed twice with 200 µl HHBS, then imaged with a fluorescence microscope using FITC channel.

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