细胞膜荧光探针，DiI，DiO，DiD，DiR，DiA，CM-DiI，神经示踪，传统细胞膜荧光探针

产品描述：

DiI, DiO, DiD和DiR作为一类长链的亲脂性二烷基碳菁类染料（Dialkylcarbocyanines）荧光染料家族，用于标记细胞膜以及其他脂溶性生物结构。作为一类环境敏感型荧光染料，当它们与膜结合或者与亲脂性生物分子（例如蛋白质，虽然在水中其荧光强度很弱）结合时，其荧光强度显著增强。一旦进入细胞后，它们在细胞内质膜中逐步扩散，于最佳浓度条件下可将整个细胞均匀染色。这些染料具很高的淬灭系数，偏光依赖性和很短的激发寿命。

四种染料呈现不同的荧光颜色，DiI（橙色荧光）、DiO（绿色荧光）、DiD（红色荧光）、DiR（深红色荧光），为活细胞多色彩荧光成像分析和流式细胞术提供了一种便捷的工具。DiO和DiI分别用标准FITC和TRITC滤光器检测，可结合使用。DiD可被633 nm氦-氖（He-Ne）激光激发，具有比DiI更长的激发和发射光波长，特别适合用于标记具本底荧光的细胞和组织。而，DiR在体内活体成像或者示踪中意义非凡，因其所发射的红外光可以高效地穿过细胞和组织，并且在红外光范围内，其本底荧光水平很低。

本品以DiD的高氯酸盐形式提供，英文名：1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-Tetramethylindodicarbocyanine Perchlorate，纯度≥95%，适用于荧光检测研究。

基本特性：

1）化学名：2-[5-(1,3-Dihydro-3,3-dimethyl-1-octadecyl-2H-indol-2-ylidene)-1,3-pentadien-1-yl]-3,3-dimethyl-1-octadecyl-3H-indolium perchlorate

2）同义名：DiD Perchlorate; DiIC18(5); 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-Tetramethylindodicarbocyanine Perchlorate;

3）推荐滤光器：Omega-XF110, XF47, Chroma-41008, 31023

4）分子式：C61H99ClN2O4

5）分子量：959.91g/mol

6）外观：紫色或深蓝色固体

7）纯度：≥95%

8）Ex/Em：644/665 nm（甲醇）

9）溶解性：溶于DMF，DMSO，甲醇

保存与运输方法

保存： -20ºC避光干燥保存，有效期一年。

运输：冰袋运输。

应用示例（来自文献）：

文献来源：Diao J et al. A single vesicle-vesicle fusion assay for in vitro studies of SNAREs and accessory proteins. Nat Protoc. 2012 May;7(5):921-34.

Single-vesicle lipid-mixing assay: In our vesicle-vesicle lipid-mixing assay, the v-and t-SNARE proteins (or vice versa) are reconstituted into two different groups of vesicles labeled with acceptor (DiD) and donor (DiI) fluorophores, respectively. The acceptor-labeled vesicles are immobilized on the surface and then the donor-labeled vesicles are added in order to observe the formation of a single vesicle-vesicle complex through specific SNARE interactions12 (Fig. 1).

1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindodicarbocyanine perchlorate, DiIC18(5) (DiD)：DiD working solution is prepared using 100% ethanol (1 mg ml− 1). CRITICAL The solvent is subject to evaporation. An absorbance measurement may be done to verify the accuracy of the dye concentration. Store the solution at −20 °C for up to 1 month without recalibration.

1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate, DiIC18(3) (DiI)：DiI working solution is prepared using 100% ethanol (1 mg ml− 1). CRITICAL The solvent is subject to evaporation. An absorbance measurement may be done to verify the accuracy of the dye concentration. Store the solution at −20 °C for up to 1 month without recalibration.

注意事项

1）荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

【注意】以下使用方法仅用作参考，可根据具体的实验条件做出调整。

1. 染色液制备

1）储存液制备：用DMSO或乙醇配置浓度1～5 mM的储存液。例如，取25mg DiD（Mw：959.91g/mol）溶于5.21ml无水DMSO中，充分溶解，即得到5mM的储存液。【注意】未使用的储存液分装储存在-20℃，避免反复冻融，且要避光保存。

2）工作液制备：用合适的缓冲液（如：无血清培养基，HBSS或PBS）稀释储存液，调整到1～5 μM的工作浓度。【注意】工作液最终浓度需要根据不同细胞系和实验体系来优化。建议从推荐浓度开始，以10倍范围为区间进行最优浓度的摸索。

2. 悬浮细胞染色

1）加入适当体积的染色工作液重悬细胞，使其密度为1×106/mL。

2）37℃孵育细胞2～20min，不同的细胞最佳培养时间不同。可以20min作为起始孵育时间，之后优化以保证得到均一化的标记结果。

3）孵育结束，按1000～1500 rpm离心5min。

4）去除上清液，之后轻柔加入37℃预热的生长培养液重悬细胞。

5）再重复3），4）步骤两次。

3. 贴壁细胞染色

1）将贴壁细胞培养于无菌盖玻片上。

2）从培养基中移走盖玻片，滤掉过量培养液，将盖玻片放在潮湿的小室内。

3）在盖玻片的一角加入100μL的染色工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。

4）37℃孵育细胞2～20min，不同的细胞最佳培养时间不同。可以20min作为起始孵育时间，之后优化以保证得到均一化的标记结果。

5）吸掉染色工作液，用培养液洗盖玻片2～3次，每次用预温的培养基覆盖所有细胞，孵育5～10min，然后吸走培养基。

4. 显微镜检测

1）DiD，DiO，DiI，DiR和DiS滤光器的选择参见下表：

2）多色染料的同时检测，滤光器按照以下设定：

a) DiI和DiO＝Omega XF52，Chroma 51004；

b) DiI和DiD＝Omega XF92，Chroma 51007；

c) DiI，DiO和DiD＝Omega XF93，Chroma 61005；

5. 流式细胞仪检测

经DiO，DiI，DiD和DiR染色的细胞分别用流式细胞仪的FL1，FL2，FL3或FL4通道检测。