产品组分：

菌株描述

DH10Bac菌株用于生产真核蛋白表达用的重组杆状病毒分子（Bac-to-Bac杆状病毒表达系统）。该菌株含有父代杆状病毒穿梭载体Bacmid（bMON14272, 136 kb）和辅助质粒pMON7124，前者含低拷贝的mini-F复制子、卡那霉素抗性基因、attTn7位点和lacZα互补因子（可通过蓝白斑筛选）；后者含四环素抗性和tnsABCD区（此区域表达转座必须的转座蛋白）。供体质粒pFastBac携带Tn7转座元件，包含庆大霉素抗性基因、杆状病毒多角体启动子、一个多克隆位点区域和SV40多聚腺苷酸化信号。将含有编码序列的供体质粒pFastBac转化进入DH10Bac细胞，pFastBac上的mini-Tn7位点和DH10Bac中Bacmid上的mini-attTn7位点之间发生转座，产生重组Bacmid。此转座导致Bacmid上的lacZ基因被破坏，因此，可通过蓝白斑筛选来鉴别含有重组Bacmid的DH10Bac阳性菌落（呈白色）。从阳性菌落中分离出重组的Bacmid DNA之后转染进入昆虫细胞，产生具感染性的重组杆状病毒颗粒即可启动外源重组蛋白的表达。表达目的蛋白的杆状病毒在被扩增和滴度测定后，高滴度的杆状病毒即可用于感染昆虫细胞以进行大规模的目的蛋白的表达。

DH10Bac菌株上的mcrA、mcrBC及mrr突变使其适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。ϕ80lacZΔM15 的存在使DH10Bac可用于蓝白斑筛选。

DH10Bac菌株基因型：F-mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) ϕ80lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1endA1araD139 ∆ (ara,leu)7697galUgalK λ-rpsLnupG /pMON14272 / pMON7124

产品描述

本品是DH10Bac菌株经特殊工艺制作所得的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。经pUC19质粒检测转化效率＞108 cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存几个月转化效率不发生改变。

保存与运输条件：

保存：-80℃保存，6个月有效。

运输：干冰运输。

注意事项

1）   感受态细胞必须用干冰运输。感受态细胞应在-80℃保存，不可反复冻融且放置时间过长，否则会减低感受态细胞的转化效率。

2）   最好在冰上融化感受态细胞。

3）   转化高浓度质粒或高效连接产物需相应减少最终涂板的菌量。

4）   进行转化操作时，需在相应温度及无菌条件下进行。

5）   为防止转化实验不成功，可保留部分连接反应液以重新转化，将损失降到最低。

6）   产品包装内含质粒pUC19 DNA(10 pg/μl)，供对照实验用。

7）   为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在无菌条件的标准下进行】

一、  供体质粒（如pFastBac）的转化步骤

1.1    从-80℃取出感受态细胞迅速置于冰浴中5min使其完全融化。

1.2    向融化的感受态细胞中加入供体质粒（1ng），用手轻弹混匀（避免用移液枪上下吹打），冰浴静置25min。

1.3    42℃水浴热激45s，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2min。此过程不要摇动离心管。

1.4    向每个离心管中加入900 μl无菌SOC培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃ 摇床，225 rpm振荡培养4h，目的使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。【注意】：此步可使用SOC之外的培养基，但转化效率会降低。用LB液体培养基转化效率最少降2-3倍。

1.5    复苏完成后，用SOC稀释转化液到10-1，10-2，将每个梯度的稀释液混匀后吸取100μl加入含相应抗生素的LB平板上，每个梯度涂3个平板，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开。平板上包含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、7μg/ml四环素、40μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG。

1.6    将平板置于室温（或37℃）直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养48h（因抗生素含量比较高，需在37℃长时间培养才能挑选到合适的阳性克隆）。

验证阳性克隆：

a）   挑选10个白色克隆（尽量选择最大且间隔最开的菌落，避免交叉污染），重新划线到LB平板（含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、7μg/ml四环素、40μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG），37℃培养过夜。

b）   挑选白色克隆，转到LB培养液（含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、7μg/ml四环素），过夜培养。

c）   用商业化的质粒抽提试剂盒（如Qiagen 12162）或传统的异丙醇-醋酸钠法抽提重组质粒DNA（＞100kb）。用PCR分析重组质粒是否正确。

附表1 固体和液体LB培养基配方

附表2 固体和液体2-YT培养基配方

附表3 液体SOB和SOC培养基配方

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产品组分：

菌株描述

DH10Bac菌株用于生产真核蛋白表达用的重组杆状病毒分子（Bac-to-Bac杆状病毒表达系统）。该菌株含有父代杆状病毒穿梭载体Bacmid（bMON14272, 136 kb）和辅助质粒pMON7124，前者含低拷贝的mini-F复制子、卡那霉素抗性基因、attTn7位点和lacZα互补因子（可通过蓝白斑筛选）；后者含四环素抗性和tnsABCD区（此区域表达转座必须的转座蛋白）。供体质粒pFastBac携带Tn7转座元件，包含庆大霉素抗性基因、杆状病毒多角体启动子、一个多克隆位点区域和SV40多聚腺苷酸化信号。将含有编码序列的供体质粒pFastBac转化进入DH10Bac细胞，pFastBac上的mini-Tn7位点和DH10Bac中Bacmid上的mini-attTn7位点之间发生转座，产生重组Bacmid。此转座导致Bacmid上的lacZ基因被破坏，因此，可通过蓝白斑筛选来鉴别含有重组Bacmid的DH10Bac阳性菌落（呈白色）。从阳性菌落中分离出重组的Bacmid DNA之后转染进入昆虫细胞，产生具感染性的重组杆状病毒颗粒即可启动外源重组蛋白的表达。表达目的蛋白的杆状病毒在被扩增和滴度测定后，高滴度的杆状病毒即可用于感染昆虫细胞以进行大规模的目的蛋白的表达。

DH10Bac菌株上的mcrA、mcrBC及mrr突变使其适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。ϕ80lacZΔM15 的存在使DH10Bac可用于蓝白斑筛选。

DH10Bac菌株基因型：F-mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) ϕ80lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1endA1araD139 ∆ (ara,leu)7697galUgalK λ-rpsLnupG /pMON14272 / pMON7124

产品描述

本品是DH10Bac菌株经特殊工艺制作所得的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。经pUC19质粒检测转化效率＞108 cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存几个月转化效率不发生改变。

保存与运输条件：

保存：-80℃保存，6个月有效。

运输：干冰运输。

注意事项

1）   感受态细胞必须用干冰运输。感受态细胞应在-80℃保存，不可反复冻融且放置时间过长，否则会减低感受态细胞的转化效率。

2）   最好在冰上融化感受态细胞。

3）   转化高浓度质粒或高效连接产物需相应减少最终涂板的菌量。

4）   进行转化操作时，需在相应温度及无菌条件下进行。

5）   为防止转化实验不成功，可保留部分连接反应液以重新转化，将损失降到最低。

6）   产品包装内含质粒pUC19 DNA(10 pg/μl)，供对照实验用。

7）   为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在无菌条件的标准下进行】

一、  供体质粒（如pFastBac）的转化步骤

1.1    从-80℃取出感受态细胞迅速置于冰浴中5min使其完全融化。

1.2    向融化的感受态细胞中加入供体质粒（1ng），用手轻弹混匀（避免用移液枪上下吹打），冰浴静置25min。

1.3    42℃水浴热激45s，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2min。此过程不要摇动离心管。

1.4    向每个离心管中加入900 μl无菌SOC培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃ 摇床，225 rpm振荡培养4h，目的使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。【注意】：此步可使用SOC之外的培养基，但转化效率会降低。用LB液体培养基转化效率最少降2-3倍。

1.5    复苏完成后，用SOC稀释转化液到10-1，10-2，将每个梯度的稀释液混匀后吸取100μl加入含相应抗生素的LB平板上，每个梯度涂3个平板，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开。平板上包含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、7μg/ml四环素、40μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG。

1.6    将平板置于室温（或37℃）直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养48h（因抗生素含量比较高，需在37℃长时间培养才能挑选到合适的阳性克隆）。

验证阳性克隆：

a）   挑选10个白色克隆（尽量选择最大且间隔最开的菌落，避免交叉污染），重新划线到LB平板（含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、7μg/ml四环素、40μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG），37℃培养过夜。

b）   挑选白色克隆，转到LB培养液（含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、7μg/ml四环素），过夜培养。

c）   用商业化的质粒抽提试剂盒（如Qiagen 12162）或传统的异丙醇-醋酸钠法抽提重组质粒DNA（＞100kb）。用PCR分析重组质粒是否正确。

附表1 固体和液体LB培养基配方

附表2 固体和液体2-YT培养基配方

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