Stbl3；Stbl2；HB101；Stable；Direct repeats 直接重复片段；Lentiviral expression vectors 慢病毒表达载体；In-fusion 一步法克隆检测试剂盒；
产品订购：
| 货号 |
产品名称 |
规格 |
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| MF2317-1000UL |
Stbl3 Chemically Competent Cell 大肠杆菌化学感受态细胞 |
10×100μl |
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| MF2317-5000UL |
Stbl3 Chemically Competent Cell 大肠杆菌化学感受态细胞 |
50×100μl |
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产品组分：
| 组分编号 |
组分名称 |
货号（规格）
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| MF2317-1000UL |
MF2317-5000UL |
| MF2317-A |
Stbl3 Competent Cell |
10×100μl |
50×100μl |
| MF2317-B |
Control Plasmid puC19, 10 pg/µl |
10μl |
10μl |
菌株描述
Stbl3菌株来源于大肠杆菌HB101菌株，特别适用于克隆不稳定插入片段比如含有直接重复序列的慢病毒DNA。与TOP10菌株不同，Stbl3菌株减少了存在于慢病毒表达载体和一些其他腺病毒载体中长末端重复序列（LTRs）的同源重组频率，有效降低错误重组。Stbl3有更高的基因组克隆容量。此菌株含链霉素抗性。
Stbl3菌株基因型：F-mcrB mrrhsdS20(rB-, mB-) recA13 supE44 ara-14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20(StrR) xyl-5 λ-leumtl-1
产品描述
本品是Stbl3菌株经特殊工艺制作所得的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。经pUC19质粒检测转化效率＞108 cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存几个月转化效率不发生改变。
保存与运输条件：
保存：-80℃保存，六个月有效。
运输：干冰运输。
注意事项
1） 对不稳定DNA克隆或逆转录病毒/慢病毒载体克隆，涂板后应在30℃培养，以减少错误重组的发生概率。
2） 制备高纯度病毒质粒，需使用新鲜转化的平板接菌，新鲜菌液提取质粒，菌液不可低温保存后使用。
3） 对不稳定的克隆或病毒质粒优先以质粒状态保存，尽量避免以转化在大肠杆菌细胞的方式保存质粒。
4） 转化时SOC或LB培养基均可用，前者能提高转化效率约20%。
5） 感受态细胞必须用干冰运输。感受态细胞应在-80℃保存，不可反复冻融且放置时间过长，否则会减低感受态细胞的转化效率。
6） 最好在冰上融化感受态细胞。
7） 进行转化操作时，需在相应温度及无菌条件下进行。
8） 为防止转化实验不成功，可保留部分连接反应液以重新转化，将损失降到最低。
9） 产品包装内含质粒pUC19 DNA(10 pg/μl)，供对照实验用。
10）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法【所有操作均在无菌条件的标准下进行】
1） 从-80℃取出感受态细胞迅速置于冰浴中5min使其完全融化。
2） 向融化的感受态细胞中加入目的DNA（根据实际情况加入适量的DNA，通常100 μl感受态细胞能够被1 ng超螺旋质粒DNA所饱和），用手轻弹混匀（避免用移液枪上下吹打），冰浴静置25-30min。
3） 42℃热击45s，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3min。此过程不要摇动离心管。
4） 向每个离心管中加入900 μl无菌的SOC或LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃ 摇床，225 rpm振荡培养60min，目的使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
【注意】：当质粒中含不稳定片段，可30℃，225rpm振荡培养90min，30℃培养能降低错误重组的概率。当转化pUC19对照，需用37℃，225rpm培养60min来复苏。】
5） 5000rpm离心1min，吸走900 μl上清，留取100μl左右吹打重悬菌体，加到含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于室温（或37℃）直至液体被吸收，倒置培养，37℃或30℃培养12-16h。
【注意】：当质粒中含不稳定片段，30℃培养能降低错误重组的概率。当转化pUC19对照，需37℃过夜培养。
【注意】：a）涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可取少量转化产物涂布平板；反之，若转化的DNA总量较少，可将所有转化产物涂布平板。b）新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。c）涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。
附表1 固体和液体LB培养基配方
| 组分Component |
LB（液体）/升 |
LB（固体）/升 |
| 胰蛋白胨Tryptone |
10g |
10g |
| 酵母提取物Yeast extract |
5g |
5g |
| 氯化钠NaCl |
10g |
10g |
| 1N NaOH |
调整pH至7.0 |
调整pH至7.0 |
| 琼脂Agar |
/ |
15g |
附表2 固体和液体SOC培养基配方
| 组分Component |
SOC（液体）/升 |
SOC（固体）/升 |
| 胰蛋白胨Tryptone |
20g |
20g |
| 酵母提取物Yeast extract |
5g |
5g |
| NaCl |
0.5g |
0.5g |
| KCl |
0.186g |
0.186g |
| MgCl2 |
0.95g |
0.95g |
| MgSO4 |
1.2g |
1.2g |
| Glucose |
3.6g |
3.6g |
| 1N NaOH |
调整pH至7.0 |
调整pH至7.0 |
| 琼脂Agar |
/ |
15g |
| 1N NaOH |
调整pH至7.0 |
调整pH至7.0 |
| 琼脂Agar |
/ |
15g |
Stbl3感受态细胞常见问题
1. 使用Stbl3感受态细胞时，如何提高病毒质粒的产量？
答复：Stbl3菌株基因组中核酸酶内切酶A1（endA1+）基因为野生型，未被突变。因此，质粒提取过程中，可能会将微量的核酸酶内切酶A1与质粒一起提取，引起质粒被降解。为了改变其对病毒质粒产量的影响，可采用以下方法来解决：
1） 使用商业化高纯度质粒提取试剂盒（推荐：Qiagen #12362 EndoFree Plasmid Maxi Kit），或其他公司含去蛋白液的质粒提取试剂盒来去除核酸酶对质粒的污染。
2） 使用质粒提取溶液I, II, III提取质粒时，确保溶液I中含10mM EDTA（EDTA能使endA1 失活），并且用酚/氯仿/异戊醇溶液多抽提几次，尽量去除残留endA1。
3） 接菌用新鲜菌落，不要使用4℃保存的菌落接菌。摇菌使用大体积容器，300rpm摇菌20h，增加溶氧量。比如，质粒小提，50ml离心管接入6ml LB菌液（含抗生素）；质粒大提，2L三角瓶内接入200ml LB菌液（含抗生素）；
4） 对不稳定的克隆或病毒质粒优先以质粒状态保存，尽量避免保存以转化到大肠杆菌细胞中的方式保存质粒。摇好的菌液应立即提取质粒，不可将菌液于室温或低温放置一段时间后再提取质粒。
5） 用Stable菌株代替Stbl3扩繁病毒质粒，因前者含endA突变，提取质粒中无核酸内切酶污染，提高了病毒质粒的产量和纯度。同时具stbl3菌株优点，可降低病毒质粒错误重组的概率。
2. 是否能用TOP10或DH5α代替Stable或Stbl3扩繁病毒质粒？
答复：可以替代，Stable或Stbl3菌株在病毒构建和扩繁过程中具有很低的错误重组概率，推荐优先使用。普通大肠杆菌如TOP10或DH5α也可扩繁病毒质粒，只是产量低一些，并且在扩繁过程中容易产生错误重组，导致一些必要元件的删除。当使用TOP10或DH5α时，最好在30℃摇菌，采用低盐浓度的LB溶液（5 g/L NaCl）以降低错误重组的概率。
3. 使用Stbl3，TOP10感受态细胞构建或扩增病毒质粒时，平板上长出的克隆有的偏大，有的偏小，如何选择哪种克隆用于后续实验？
答复：推荐挑选直径偏小克隆进行后续实验，Stbl3和TOP10在构建或扩繁病毒质粒过程中都有可能产生末端重复区的错误重组（Stbl3菌株错误重组率约30%；TOP10菌株错误重组率约70%），发生错误重组的病毒质粒赋予该克隆生长速度加快的优势，因而长成直径偏大的克隆。
4. Stbl3的基因型为F-mcrB mrrhsdS20(rB-, mB-) recA13 supE44 ara-14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20(StrR) xyl-5 λ-leu mtl-1，如何理解各个基因？
| F´ |
A self-transmissible, low-copy plasmid used for the generation of single-stranded DNA when infected with M13 phage; may contain a resistance marker to allow maintenance and will often carry the lacI and lacZ∆M15 genotypes |
| mcrA, mcrBC,or mrr |
Mutations that allow methylated DNA to not be recognized as foreign; this genotype is necessary when cloning genomic DNA or methylated cDNA |
| hsd |
Mutations in the system of methylation and restriction that allow E. coli to recognize DNA as foreign. The hsd genotype allows efficient transformation of DNA generated from PCR reactions *hsdR–eliminates restriction of unmethylated EcoK I sites. (1) **hs |
| recA |
Mutation in a gene responsible for general recombination of DNA; particularly desirable when cloning genes with direct repeats |
| supE,F |
tRNA glutamine suppressor of amber (supE)(UAG) or tyrosine (supF) |
| ara-14 |
Blocks arabinose catabolism |
| galK |
Galactokinase mutation blocks catabolism of galactose—cells that are galK minus grow in the presence of galactose as the sole carbon source |
| lacY1 |
Blocks use of lactose via β-D-galactosidase mutant |
| proAB |
proAB Requires proline for growth on minimal media |
| rpsL |
Confers resistance to streptomycin (this makes a mutant ribosomal protein, small subunit, the target of the drug) |
| xyl-5 |
Blocks catabolism of xylose |
| leuB |
Requires leucine for growth on minimal media via β-isopropyl malate dehydrogenase mutation |
| dam/dcm |
Abolishes endogenous adenine methylation at GATC sequences (dam) or cytosine methylation at CCWGG sequences (dcm). Used to propagate DNA for cleavage with certain restriction enzymes (e.g. Ava II, Bcl I) |
| lacI |
Encodes the lac repressor that controls expression from promoters that carry the lac operator; IPTG binds the lac repressor and derepresses the promoter; often used when performing blue/white screening or to control expression of recombinant genes |
| lacZ∆M15 |
Element required for β-galactosidase complementation when plated on X-gal; used in blue/white screening of recombinants; usually carried on the lambdoid prophage φ80 or F´ |
| DE3 |
Lysogen that encodes T7 RNA polymerase. Used to induce expression in T7-driven expression systems |
| relA |
RNA is synthesized in absence of protein synthesis (relaxed phenotype) relA locus regulates the coupling between transcription and translation. In the wild type, limiting amino acid concentrations results in the shutdown of RNA synthesis |
| Tn10 |
Confers tetracycline resistance via a transposon |
5. 转化过程中感受态细胞的复苏必须使用SOC培养基？
许多培养基都能用于感受态细胞的生长，包括标准的LB，SOB或TB肉汤。然而，SOC是涂板前感受态细胞复苏的最佳选择，因其添加葡萄糖后营养富集的配方在获得最大转化效率方面通常很重要。
