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产品名称
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规格 |
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Caspase-9活性检测试剂盒（荧光法）
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20T |
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| Caspase-9活性检测试剂盒（荧光法） |
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100T |
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产品描述
Caspases（Cysteine-requiringAspartate Proteases）是一个高度保守的半胱氨酸蛋白酶家族，特异性识别底物中的天冬氨酸残基，在介导细胞凋亡的过程中发挥着非常重要的作用。Caspases以潜在酶原的形式表达，通过自发蛋白分解机制或经其他蛋白酶（通常是其他caspases）加工处理的方式被活化。人caspases可细分为三大功能组：细胞因子活化（caspase-1，-4，-5和-13），凋亡启动（caspase-2，-8，-9和-10）和凋亡执行（caspase-3，-6和-7）。
Caspase-9（Caspase9），也称为Mch6，ICE LAP6和Apaf3，作为caspases家族的成员之一，含CARD结构域（caspase募集结构域），是细胞凋亡信号转导过程中比较上游的一个caspase。Caspase-9酶原分子量约47kDa，存在于胞浆内，一旦活化，转移到线粒体。Caspase-9参与caspase活化级联，负责凋亡执行，和切割/活化下游的caspase-3和caspase-6。当募集到Apaf1/细胞色素c复合物后，caspase-9被激活。Caspase-9的激活可通过磷酸化进行调控。
Caspase-9活性检测试剂盒（荧光法）（Caspase-9 Activity Assay Kit, Fluorometric or Caspase-9 Fluorometric Assay Kit）以偶联上发色基团AFC的caspase-9序列特异性的多肽为底物。当底物被caspase-9剪切后，发色基团被释放出来，进而用荧光酶标仪或荧光光度计来测定其荧光强度（激发波长=485nm，发射波长=535nm）。通过计算RFU凋亡诱导组/RFU阴性对照组的比值来确定凋亡诱导组caspase-9的活化程度。
本品适用于培养细胞以及新鲜组织的caspase-9活性检测。
产品包装
| 编号 |
组分名称 |
保存方法 |
货号（规格） |
| MX3234-20T |
MX3234-100T |
| A |
Lysis Buffer裂解缓冲液 |
2-8℃ |
5ml |
20ml |
| B |
2× Reaction Buffer 2×反应缓冲液 |
2-8℃ |
2ml |
10ml |
| C |
Caspase-9 Substrate Caspase-9底物 |
-20℃避光 |
6μl |
30μl |
| D |
0.1M DTT |
-20℃避光 |
60μl |
250μl |
保存与运输方法
保存：-20℃保存，1年有效。开盒后置Lysis Buffer和2× Reaction Buffer于2-8℃保存。Caspase-9 Substrate和0.1M DTT需要避光冻存。
运输：冰袋运输。
注意事项
1） Caspase-9 Substrate需避光保存和使用。
2） 某些凋亡诱导剂诱导的凋亡可能通过caspase-9非依赖的方式进行，此种情况使用本品检测的caspase-9活性无明显变化，则，需要考虑凋亡机制中的其他信号通路。
3） 起始细胞数量需达3~5×106个或新鲜组织量达50~100mg，以保证达到测定所需的100~200μg蛋白量。Caspase-9的活性与细胞裂解后的蛋白含量有关，如测定的RFU值偏低，可通过适当延长反应时间来操作。但如果测定的RFU值依然不高，则要通过增加细胞数量或组织量的方法来提高蛋白量。
4） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
1.需要的其他试剂和材料
仪器：低温高速离心机、荧光酶标仪、微量移液器、玻璃匀浆器（组织样本）
耗材：1.5ml微量离心管、白色或黑色（不透明、平底）的96孔酶标板
试剂：PBS、蛋白定量试剂（比如：Bradford法蛋白浓度测定试剂盒）、ddH2O
2.试剂准备
2.1 Lysis Buffer（含DTT）
于实验前，按每50μl Lysis Buffer 加入0.5μl DTT的比例准备足量的裂解工作液，置于4℃或冰上待用。
2.2 2×Reaction Buffer（含DTT）
于使用前，按每50μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl DTT的比例准备足量的反应工作液。
2.3 Caspase-9 Substrate工作液
将Caspase-9 Substrate从冰箱内取出，置于室温（或25℃水浴）使其充分融化，低速离心使其沉至管底。于使用前，按照19.5μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl Caspase-9 Substrate的比例准备足量的Caspase-9 Substrate工作液。
3.样本准备
3.1 细胞裂解
a）用合适方法诱导细胞凋亡，同时设立阴性对照组（不加诱导剂），收集3~5×106个细胞。
b）PBS洗涤细胞2次（2000rpm，离心5min），尽量吸尽PBS上清。
c）往离心的沉淀细胞中加入100μl预冷的Lysis Buffer（含DTT），吹打混匀。
d）置冰上裂解20~60min，其间涡旋振荡3~4次，每次10s；或冻融2~3次。
e）4℃，10,000rpm离心1min。
f）小心吸取上清（含裂解释放的蛋白质）转移到新的EP管内，置于冰上待用。
g）取少量上清（1~2μl），用常规方法（Bradford法）测定蛋白浓度。
3.2 组织裂解
a）取50~100mg组织置于培养皿内，用手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块，加入150~200μl预冷的Lysis Buffer（含DTT），用玻璃匀浆器上下手动匀浆15次，注意低温操作。
b）将组织匀浆液转移到1.5ml预冷的离心管，10,000rpm，4℃离心5min。
c）小心吸取上清（含裂解释放的蛋白质）转移到新的EP管内，置于冰上待用。
d）取少量上清（1~2μl），用常规方法（Bradford法）测定蛋白浓度。
4.Caspase-9活性检测
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