Plant Protoplast 植物原生质体；PEG-mediated protoplast transformation 聚乙二醇介导的原生质体转化；Yakult Honsha；Cellulase R-10纤维素酶R-10；Macerozyme R-10离析酶R-10；二乙酸荧光素(FDA) 原生质体活力检测；

产品信息

原生质体（Protoplast）是指植物细胞去掉细胞壁后的裸露部分，体外培养条件下，具有以下功能：1）具全能型，可再生细胞壁，进行连续的细胞分裂且能再生成完整植株的能力；2）具摄取外源大分子、细胞器，以及细菌、病毒的能力，从而原生质体是进行遗传操作，基因转移的良好材料；3）通过同种和异种植物的原生质体融合，可产生异核体，实现体细胞杂交，从而培育出具有抗病原或更高产量的新品种。

原生质体（Protoplast）的制备最主流的技术是酶解法，因其具有消化温柔，操作简单，且良好维持原生质体完整性的特点。工作原理是根据植物细胞壁的结构特征选择合适的酶进行处理，植物细胞壁主要由多糖（纤维素、半纤维素、果胶等）以及少量的蛋白和脂质构成。因此，通过使用纤维素酶、离析酶、半纤维素酶、果胶酶等复合酶来降解细胞壁，即可得到原生质体。

原生质体（Protoplast）的转化方法很多，主要有PEG介导转化法、电击穿孔转化法、脂质体介导转化法、农杆菌共培养转化法等。本试剂盒利用的是PEG介导的原生质体转化法，利用PEG短时间内对原生质体产生的冲击效应，促使质粒DNA、RNA或蛋白质进入原生质体，经转化后的原生质体培养一段时间后，可用于检测外源基因的表达或基因编辑效果等研究。本试剂盒操作简单和便捷，含原生质体转化需要的试剂，按照每次转化100μl原生质体溶液，可做至少40次转化。

试剂盒组分

保存与运输方法

保存：-20℃保存，1年有效。 

运输：室温运输。

注意事项

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、 需要准备材料

二、 原生质体转化

2.1按照以下表1，根据实际样品量配制所需的即用型转化溶液D，需在转化开始前至少1h配制转化溶液，以确保转化试剂能充分的溶解。转化溶液建议配制当天使用。配制好的转化溶液于4℃保存3-5天内会维持相对较好的转化效率，但与现配的转化溶液相比，转化效率会有一定程度的下降。

2.2取10μl质粒DNA（10-20μg，浓度为1-2μg/μl）于1.5ml离心管。

【注①】：质粒大小建议在5-10kb，质粒浓度建议在1-2μg/μl。原生质体转化对质粒的纯度要求较高，尽量使用高纯质粒。多个质粒同时转化时的体积和总质量保持不变。多个质粒转化时，每种质粒的用量比例，根据实际情况自行调整。

2.3 加入100μl原生质体溶液（原生质体密度为2×105个/ml，约2万个原生质体），轻柔混匀。

2.4 加入等体积（110μl）新鲜配制的即用型转化溶液D，轻柔完全混匀，室温25℃孵育5-15min，间歇轻柔混匀。

【注①】：通常孵育5min足够，但需要根据实际体系来优化调整，最长孵育15min。

2.5 加入2倍体积（440μl）溶液B，轻柔完全混匀，终止转化过程。

2.6 于100×g，室温离心1-2min，吸掉上清。

【注①】：由于转化后的溶液非常粘稠，加入溶液B后离心1min通常可以使得原生质体聚集在管底，但是，使用某些突变体时为了减少原生质体损失，可以延长离心时间到2min。

2.7 加入500μl溶液B轻轻重悬原生质体，于100×g，室温离心1min，吸掉上清。此步目的是为了充分去除转化液内残留组分，避免后续可能产生的负面影响。

2.8 将沉淀重悬于1ml溶液E中，轻柔混匀。

三、 原生质体培养和收集

3.1 将离心管水平放置，于25℃弱光培养2-16h。

【注①】：根据特定实验确定孵育时间。RNA分析一般孵育2-6h；酶活性分析和蛋白标记一般孵育2-16h。基因编辑效果可能在24h后被检测到。

3.2 【可选】于100×g，室温离心2min收集原生质体，去掉大部分上清。

3.3 【可选】原生质体沉淀重悬于剩余溶液中，-80℃保存。

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Plant Protoplast 植物原生质体；PEG-mediated protoplast transformation 聚乙二醇介导的原生质体转化；Yakult Honsha；Cellulase R-10 纤维素酶R-10；Macerozyme R-10 离析酶R-10；二乙酸荧光素(FDA) 原生质体活力检测；

产品信息                                                                                                            

原生质体（Protoplast）是指植物细胞去掉细胞壁后的裸露部分，体外培养条件下，具有以下功能：1）具全能型，可再生细胞壁，进行连续的细胞分裂且能再生成完整植株的能力；2）具摄取外源大分子、细胞器，以及细菌、病毒的能力，从而原生质体是进行遗传操作，基因转移的良好材料；3）通过同种和异种植物的原生质体融合，可产生异核体，实现体细胞杂交，从而培育出具有抗病原或更高产量的新品种。

原生质体（Protoplast）的制备最主流的技术是酶解法，因其具有消化温柔，操作简单，且良好维持原生质体完整性的特点。工作原理是根据植物细胞壁的结构特征选择合适的酶进行处理，植物细胞壁主要由多糖（纤维素、半纤维素、果胶等）以及少量的蛋白和脂质构成。因此，通过使用纤维素酶、离析酶、半纤维素酶、果胶酶等复合酶来降解细胞壁，即可得到原生质体。

原生质体（Protoplast）的转化方法很多，主要有PEG介导转化法、电击穿孔转化法、脂质体介导转化法、农杆菌共培养转化法等。

本试剂盒是PEG介导的原生质体转化法，操作简单和便捷。试剂盒含有植物原生质体制备（包含消化酶和细胞筛网）和植物转化需要的所有试剂，按照单次10ml酶液体系来算，可做20次。

试剂盒组分

保存与运输方法

保存：按照说明书要求对各组分进行归位保存，1年有效。

运输：室温运输。

注意事项

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1. 需要准备材料

1. 1. 平头镊子
   2. 一次性刀片
   3. 1.5ml离心管
   4. 50ml离心管
   5. 恒温加热水浴锅

1. 原生质体分离

2.1按照以下表格体系，配制即用型酶溶液：【注意：此溶液现配现用】

2.2 取生长状态良好的叶片切成0.5-1mm的小条，按照20个叶片加10ml即用型酶溶液的比例迅速将切好的叶片小条浸泡于即用型酶溶液内，室温避光酶解3h。

【注意】：酶解时间与叶片类型、叶片生长状态有关，请根据实际实验进行调整。酶溶液变为绿色表明原生质体已经分离，显微镜镜检确定是否分离。

2.3 酶解后加入10ml溶液B，轻柔混匀。

2.4 用70μm细胞筛网过滤步骤2.3获得的溶液，去除未消化的叶片和杂质，收集滤液到50ml离心管内。

2.5 滤液于100×g，室温离心2min，吸掉上清。

2.6 加1ml溶液B重悬原生质体，冰浴30min，使得原生质体自然沉淀到底部。

2.7 小心吸掉上清，不要触动原生质体沉淀。将沉淀重悬于1ml溶液C，即得到原生质体溶液。

2. 原生质体转化

3.1取10μl质粒DNA（浓度为1-2μg/μl）于1.5ml离心管。

3.2加入100μl原生质体溶液，轻柔混匀。

3.3加入等体积（110μl）溶液D，轻柔完全混匀，室温孵育15min，间歇轻柔混匀。

3.4加入2倍体积（440μl）溶液B，轻柔完全混匀，终止转化过程。

3.5于100×g，室温离心2min，吸掉上清。

3.6将沉淀重悬于1ml溶液E中。

2. 原生质体培养和收集

4.1原生质体溶液室温孵育2-16h。

【注意】：根据特定实验确定孵育时间。RNA分析一般孵育2-6h；酶活性分析和蛋白标记一般孵育2-16h。

4.2于100×g，室温离心2min收集原生质体，去掉大部分上清。

4.3原生质体沉淀重悬于剩余溶液中，-80℃保存。