Plant Protoplast 植物原生质体；PEG-mediated protoplast transformation 聚乙二醇介导的原生质体转化；Yakult Honsha；Cellulase R-10纤维素酶R-10；Macerozyme R-10离析酶R-10；二乙酸荧光素(FDA) 原生质体活力检测；
产品信息
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产品名称 |
产品编号 | 规格 | |
| Plant Protoplast Transformation Kit (PEG-Mediated) | MX7383-40T | 40T |
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原生质体（Protoplast）是指植物细胞去掉细胞壁后的裸露部分，体外培养条件下，具有以下功能：1）具全能型，可再生细胞壁，进行连续的细胞分裂且能再生成完整植株的能力；2）具摄取外源大分子、细胞器，以及细菌、病毒的能力，从而原生质体是进行遗传操作，基因转移的良好材料；3）通过同种和异种植物的原生质体融合，可产生异核体，实现体细胞杂交，从而培育出具有抗病原或更高产量的新品种。
原生质体（Protoplast）的制备最主流的技术是酶解法，因其具有消化温柔，操作简单，且良好维持原生质体完整性的特点。工作原理是根据植物细胞壁的结构特征选择合适的酶进行处理，植物细胞壁主要由多糖（纤维素、半纤维素、果胶等）以及少量的蛋白和脂质构成。因此，通过使用纤维素酶、离析酶、半纤维素酶、果胶酶等复合酶来降解细胞壁，即可得到原生质体。
原生质体（Protoplast）的转化方法很多，主要有PEG介导转化法、电击穿孔转化法、脂质体介导转化法、农杆菌共培养转化法等。本试剂盒利用的是PEG介导的原生质体转化法，利用PEG短时间内对原生质体产生的冲击效应，促使质粒DNA、RNA或蛋白质进入原生质体，经转化后的原生质体培养一段时间后，可用于检测外源基因的表达或基因编辑效果等研究。本试剂盒操作简单和便捷，含原生质体转化需要的试剂，按照每次转化100μl原生质体溶液，可做至少40次转化。
试剂盒组分
| 组分编号 | 组分名称 | 规格（40T） | 储存方法 |
| MX7383-B | Solution B-W5solution 溶液B | 50ml | -20℃保存 |
| MX7383-D | Solution D1-Transformationsolution (powder)粉末D1 | 2g | RTor -20℃保存 |
| Solution D2- Reconstitution solution (2×)溶液D2 | 3ml | -20℃保存 | |
| MX7383-E | Solution E-WIsolution溶液E | 50ml | -20℃保存 |
保存与运输方法
保存：-20℃保存，1年有效。
运输：室温运输。
注意事项
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
一、 需要准备材料
| 1.1平头镊子 | 1.2一次性刀片 |
| 1.3 1.5ml离心管 | 1.450ml离心管 |
| 1.4 恒温加热水浴锅 | 1.5剪尖吸头（剪尖后可以用酒精灯过火将吸头处理平滑） |
二、 原生质体转化
2.1按照以下表1，根据实际样品量配制所需的即用型转化溶液D，需在转化开始前至少1h配制转化溶液，以确保转化试剂能充分的溶解。转化溶液建议配制当天使用。配制好的转化溶液于4℃保存3-5天内会维持相对较好的转化效率，但与现配的转化溶液相比，转化效率会有一定程度的下降。
| 表1 即用型转化溶液B配制参考表 | |||
| 组分 | 1个样品 | 10个样品 | 20个样品 |
| Transformation solution (powder)粉末D1 | 48mg | 480mg | 960mg |
| Reconstitution solution (2×)溶液D2 | 60μl | 0.6ml | 1.2ml |
| 无菌水 | 定容到120μl | 定容到1.2ml | 定容到2.4ml |
2.2取10μl质粒DNA（10-20μg，浓度为1-2μg/μl）于1.5ml离心管。
【注①】：质粒大小建议在5-10kb，质粒浓度建议在1-2μg/μl。原生质体转化对质粒的纯度要求较高，尽量使用高纯质粒。多个质粒同时转化时的体积和总质量保持不变。多个质粒转化时，每种质粒的用量比例，根据实际情况自行调整。
2.3 加入100μl原生质体溶液（原生质体密度为2×105个/ml，约2万个原生质体），轻柔混匀。
2.4 加入等体积（110μl）新鲜配制的即用型转化溶液D，轻柔完全混匀，室温25℃孵育5-15min，间歇轻柔混匀。
【注①】：通常孵育5min足够，但需要根据实际体系来优化调整，最长孵育15min。
2.5 加入2倍体积（440μl）溶液B，轻柔完全混匀，终止转化过程。
2.6 于100×g，室温离心1-2min，吸掉上清。
【注①】：由于转化后的溶液非常粘稠，加入溶液B后离心1min通常可以使得原生质体聚集在管底，但是，使用某些突变体时为了减少原生质体损失，可以延长离心时间到2min。
2.7 加入500μl溶液B轻轻重悬原生质体，于100×g，室温离心1min，吸掉上清。此步目的是为了充分去除转化液内残留组分，避免后续可能产生的负面影响。
2.8 将沉淀重悬于1ml溶液E中，轻柔混匀。
三、 原生质体培养和收集
3.1 将离心管水平放置，于25℃弱光培养2-16h。
【注①】：根据特定实验确定孵育时间。RNA分析一般孵育2-6h；酶活性分析和蛋白标记一般孵育2-16h。基因编辑效果可能在24h后被检测到。
3.2 【可选】于100×g，室温离心2min收集原生质体，去掉大部分上清。
3.3 【可选】原生质体沉淀重悬于剩余溶液中，-80℃保存。
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