植物原生质体分离与转化试剂盒I（PEG法）Plant Protoplast 植物原生质体

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产品变更声明：

①   为了更清晰说明本试剂盒的用途，现将本试剂盒更名为：原生质体分离与转化试剂盒（英文名：Plant Protoplast Isolation and Transformation Kit）。

②   本试剂盒对于大多数的样本（0.1g叶片）用5ml酶反应体系足够，因此产品规格由原来的20T（按照10ml酶反应体系）更新为：40T（按照5ml酶反应体系）。

③  两款试剂盒选择上的考虑：

A）试剂盒I：含植物原生质体制备（不包含消化酶）和植物转化需要的所有试剂，需用户自行准备消化酶。由于不同植物样本，在原生质体制备消化酶的搭配组合上有所差异，特别是富含纤维素或果胶的特殊样。此类样本的用户推荐单独购买酶，自行优化最佳的酶消化组合，以获得高质量的原生质体。我司提供完整的几款植物消化酶：

纤维素酶R-10；离析酶R-10；纤维素酶RS；果胶酶Y-23；半纤维素酶；崩溃酶；几丁质酶；

B）试剂盒II：含植物原生质体制备（包含消化酶和细胞筛网）和植物转化需要的所有试剂，此试剂盒包含纤维素酶R-10和离析酶R-10，适用于绝大多数植物样本（比如：拟南芥）。

产品关键词：

Plant Protoplast 植物原生质体；PEG-mediated protoplast transformation 聚乙二醇介导的原生质体转化；Yakult Honsha；Cellulase R-10 纤维素酶R-10；Macerozyme R-10 离析酶R-10；二乙酸荧光素 (FDA) 原生质体活力检测；

产品信息                                                                                                            

产品名称

 产品编号         规格        
植物原生质体分离与转化试剂盒I（PEG法） MX7381-40T 40T

【温馨提示II】：如果需要含消化酶和细胞筛网的试剂盒，可选择原生质体转化试剂盒II（PEG法），也可以单买这几个组分，我司皆有供应。

产品描述

原生质体（Protoplast）是指植物细胞去掉细胞壁后的裸露部分，体外培养条件下，具有以下功能：1）具全能型，可再生细胞壁，进行连续的细胞分裂且能再生成完整植株的能力；2）具摄取外源大分子、细胞器，以及细菌、病毒的能力，从而原生质体是进行遗传操作，基因转移的良好材料；3）通过同种和异种植物的原生质体融合，可产生异核体，实现体细胞杂交，从而培育出具有抗病原或更高产量的新品种。

原生质体（Protoplast）的制备最主流的技术是酶解法，因其具有消化温柔，操作简单，且良好维持原生质体完整性的特点。工作原理是根据植物细胞壁的结构特征选择合适的酶进行处理，植物细胞壁主要由多糖（纤维素、半纤维素、果胶等）以及少量的蛋白和脂质构成。因此，通过使用纤维素酶、离析酶、半纤维素酶、果胶酶等复合酶来降解细胞壁，即可得到原生质体。

原生质体（Protoplast）的转化方法很多，主要有PEG介导转化法、电击穿孔转化法、脂质体介导转化法、农杆菌共培养转化法等。

本试剂盒利用的是PEG介导的原生质体转化法，操作简单和便捷。试剂盒含有植物原生质体制备（不包含消化酶）和植物转化需要的所有试剂。原生质体制备，按照单次5ml酶液体系来算，可做40次酶消化反应；原生质体转化，按照每次转化100μl原生质体溶液，可做至少40次转化。

试剂盒组分

组分编号       组分名称 规格（20T）    储存方法       
MX7381-A Solution A-Enzyme solution buffer (2×)溶液A      100ml -20℃保存
MX7381-B Solution B-W5 solution溶液B 200ml -20℃保存
MX7381-C Solution C-MMG solution溶液C 25ml -20℃保存
MX7381-D Solution D-Transformation solution溶液D 2.5ml -20℃保存
MX7381-E Solution E-WI solution溶液E 25ml -20℃保存
MX7381-F Solution F-Reduced reagent溶液F 1ml RT保存
MX7381-G Solution G-BSA solution (50mg/ml) 5ml -20℃保存

保存与运输方法

保存：按照说明书要求对各组分进行归位保存，1年有效。

运输：室温运输。

注意事项

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、需要准备材料

1.1    离析酶R-10

1.2    纤维素酶R-10

1.3    70μm细胞筛网（比如，Cat#：352350, BD Bioscience）

1.4    平头镊子

1.5    一次性刀片

1.6    1.5ml离心管

1.7    50ml离心管

1.8    恒温加热水浴锅

二、原生质体分离

2.1 按照以下表格体系，配制即用型酶溶液：【注意：此溶液现配现用】

组分

 10ml配制量          50ml配制量        

溶液A (2×酶溶解液)

 5ml 50ml

离析酶R-10

 40mg 200mg

纤维素酶R-10

 150mg

750mg
溶液F（还原剂） 5 μl

25μl
溶液G（50mg/ml BSA） 0.2ml

1ml
无菌水 定容到10ml

定容到50ml

2.2 取生长状态良好的叶片切成0.5-1mm的小条，按照20个叶片加10ml即用型酶溶液的比例迅速将切好的叶片小条浸泡于即用型酶溶液内，室温避光酶解3h。

【注意】：酶解时间与叶片类型、叶片生长状态有关，请根据实际实验进行调整。酶溶液变为绿色表明原生质体已经分离，显微镜镜检确定是否分离。

2.3 酶解后加入10ml溶液B，轻柔混匀。

2.4 用70μm细胞筛网过滤步骤2.3获得的溶液，去除未消化的叶片和杂质，收集滤液到50ml离心管内。

2.5 滤液于100×g，室温离心2min，吸掉上清。

2.6 加1ml溶液B重悬原生质体，冰浴30min，使得原生质体自然沉淀到底部。

2.7 小心吸掉上清，不要触动原生质体沉淀。将沉淀重悬于1ml溶液C，即得到原生质体溶液。

三、原生质体转化

3.1 取10μl质粒DNA（浓度为1-2μg/μl）于1.5ml离心管。

3.2 加入100μl原生质体溶液，轻柔混匀。

3.3 加入等体积（110μl）溶液D，轻柔完全混匀，室温孵育15min，间歇轻柔混匀。

3.4 加入2倍体积（440μl）溶液B，轻柔完全混匀，终止转化过程。

3.5 于100×g，室温离心2min，吸掉上清。

3.6 将沉淀重悬于1ml 溶液E中。

四、原生质体培养和收集

4.1 原生质体溶液室温孵育2-16h。

【注意】：根据特定实验确定孵育时间。RNA分析一般孵育2-6h；酶活性分析和蛋白标记一般孵育2-16h。

4.2 于100×g，室温离心2min收集原生质体，去掉大部分上清。

4.3 原生质体沉淀重悬于剩余溶液中，-80℃保存。

文献引用：  

1）Xue LJ et a al.Two antagonistic effect genes mediate separation of sexes in a fully dioecious plant. https://doi.org/10.1101/2020.03.15.993022

  Isolation of Populus mesophyll protoplasts was performed using the PEG-Mediated plant protoplast transformation kit (Shanghai  Maokang Biotechnology, China) with 3% cellulose R10 (Yakult Pharmaceutical, Japan) and 0.8% macerozyme R10 (Yakult Pharmaceutical, Japan). The middle section of expanded Populus leaves (micropropagated Populus clone ‘Nanlin 895’) were cut into 0.5~1 mm fine strips, digested for 30 min in the dark using a desiccator for Vacuum infiltrate, and succeeded with digestion in the dark for 5 h without shaking. The protoplasts were harvested by filtering through a 70 μm pore nylon cloth and then suspended in 535 the transfection.