Cosmobio CSR-SYN01-COS α-突触核蛋白聚集检测试剂盒说明书

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Cosmobio CSR-SYN01-COS α-突触核蛋白聚集检测试剂盒说明书

α-突触核蛋白聚集检测试剂盒是模仿在路易体痴呆/帕金森病/多系统萎缩发现的细胞内α-突触核蛋白聚集。

在细胞培养检测中的细胞凝集抑制和/或预防作用可用此试剂盒检测。

【Ⅰ】Introduction

Dementia is a disease that causes memory and judgement loss,

there is no fundamental treatment developed for it. Years of scientific research has proven that protein aggregation occurs in the degeneration part of the brain for many neurodegenerative diseases including dementia, indicating appearance of this

aggregation is closely related to these diseases development and progression.

Aggregation occurs when normal protein forms abnormal structure for particular

reasons and accumulates in the cell, which each disease has different aggregating protein. It is known that protein called “ α -Synuclein“ forms abnormal structure in Parkinson Disease / Lewy Body Dementia / Multiple system atrophy patient brain.

α -Synuclein Aggregation Assay Kit mimics intracellular aggregation of “ α -Synuclein“, which allows in vitro screening of active ingredients.

【一】简介

痴呆症是一种导致记忆力和判断力丧失的疾病，没有针对它开发的基本治疗方法。 多年的科学研究证明，许多神经退行性疾病包括痴呆症，蛋白质聚集发生在大脑的退化部分，表明这种聚集的出现与这些疾病的发展和进展密切相关。

当正常蛋白质由于特定原因形成异常结构并在细胞中积累时，就会发生聚集，每种疾病都有不同的聚集蛋白。 已知称为“α-突触核蛋白”的蛋白质在帕金森病/路易体痴呆/多系统萎缩患者大脑中形成异常结构。

α-突触核蛋白聚集检测试剂盒模拟“α-突触核蛋白”的细胞内聚集，可在体外筛选活性成分。

【Ⅱ -1】Kit Components

Storage：4℃  Do not freeze

  • αSynuclein Aggregation Assay Kit can be used up to 300 wells
  •  (24 well plate size) when prepared as described in【III-2】(page 2).
  • Plasmidvectors of α -Synuclein Aggregation Assay Kit are generated by

【Ⅱ -2】Required but not provided:

  • SH-SY5Ycell line
  • Culturemedium (recommended: DE/F-12, 10％ FBS, 1％ NEAA)
  • Opti-MEM®or Serum-Free medium (e.g. ThermoFisher Scientific,  no. 31985062)
  • DNase,RNase-Free sterile purified water

* Please perform steps Ⅲ -1 through Ⅲ -3 under germless condition in clean bench.

【Ⅲ -1】Preparation of working solution

  • pCMV-SNCA (α – Synuclein Expression plasmid vector, Red cap), pCMV-NC（Negative control vector, Green cap）, pCMV-dGFP（dGFP Expression plasmid vector, Blue cap）

Please adjust concentration with sterile purified water based on your amount needs (just before use).

e.g. 1uL/well of 10 fold dilution when used for 24 well plate size.

  • F-α Syn ( α – Synuclein Fibrils, Yellow cap)

Please adjust concentration with sterile purified water based on your amount needs (just before use).

e.g. 1uL/well of 10 fold dilution when used for 24 well plate size.

* CAUTION: Prior to disposing F- α Syn, please autoclave (134 ℃ , 20 min.),

or add SDS (>3%) prior to autoclave (121℃ , 20min.). If above condition cannot be matched, please dispose accordingly to your local rules and regulations.

  • MultiFectam(Gene transfection reagent）

Add 1mL of sterile purified water (room temp.) to MultiFectam and let it sit still for c.a. 10sec., vortex thoroughly. Reagent can be used up to 3 months (4 ℃ ) or 6 months (-20 ℃ ) following reconstitution. Performance of MultiFectam after reconstitution is guaranteed up to 6 times of freeze-thaw cycle; to prevent it below 6 times or less, please aliquot reconstituted reagent into multiple vials.

【Ⅲ -2】How to use the kit

  • Belowexample is for use of SH-SY5Y cell
  • Forthe 1st try out or when using other cell lines, please perform preliminary experiment by
  • adjusting usage amount of pCMV-dGFP plasmids based on below protocol.

1   Culture necessary cell amount for preliminary experiment.

3   When cells becomes confluent (typically 1-3 days depends on cell line and culture medium conditions), follow methods in below【III-3】to adjust pCMV-SNCA and F- α Syn concentration to add into medium.

【Ⅲ-2】工具包使用方法
以下示例用于使用 SH-SY5Y 细胞
第一次尝试或使用其他细胞系时，请根据以下方案调整 pCMV-dGFP 质粒的使用量来进行初步实验。
1 初步实验所需的培养细胞数量。

3 当细胞融合时（通常 1-3 天取决于细胞系和培养基条件），按照下面【III-3】中的方法调整 pCMV-SNCA 和 F-α Syn 浓度以添加到培养基中。

【Ⅲ -3】Preparation example of pCMV-SNCA / F- α Syn / MultiFectam

  • Belowexample is for preparation of 1 well of 24 well plate size (culture medium 5 mL/well).

Combine reagents according to the table below.

Transfection test Example
10 fold diluted pCMV-SNCA( if negative control: pCMV-NC) – 23 µL
10 fold diluted F- α Syn – 1 µL(0.125 µg/ well)
pCMV-dGFP 0.05 ～ 0.5 µg/well 1 µL (0.1 µg/ well)
20 mM Tris-HCl Buffer（pH 7.4） up to 25 µL 23 µL(up to 25 µL)
Total 25 µL 25 µL 25 µL
组成 容量 规格 保存
　pCMV-SNCA (α – Synuclein 表达质粒载体, 红盖)
(浓度1.25 μg/μL)		 32 μL 1 小瓶 4°C
不冻结
　pCMV-NC(阴性对照载体, 绿盖)
(浓度1.25 μg/μL)		 5 μL 1 小瓶
　pCMV-dGFP(dGFP 表达质粒载体, 蓝盖)
(浓度1.25 μg/μL)		 5 μL 1 小瓶
　20 mM Tris-HCl Buffer (pH7.4) 10 mL 1 瓶
　F-αSyn (α – Synuclein 纤维, 黄盖)
(浓度1 μg/μL)		 32 μL 1 小瓶
　Multifectam (基因转染试剂) 0.33 mg 1 瓶

* When confirming transfection efficiency by pCMV-dGFP expression, adjust plasmid amount to become 0.05 ～ 0.5 µg/well.

Replace F- α Syn (1 µL) with 20 mM Tris-HCl Buffer（pH 7.4）. Excitation/fluorescent wavelength of dGFP is 510/521 nm.

3   Add 22 µL Opti-MEM® or Serum-Free medium, mix the reaction by vortexing to ensure that all reagents are thoroughly mixed. After mixing, spin down and incubate at room temperature for 5 min (still standing).

* 当通过 pCMV-dGFP 表达确认转染效率时，将质粒量调整为 0.05 ～ 0.5 µg/孔。

用 20 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）替换 F-α Syn (1 µL)。 dGFP 的激发/荧光波长为 510/521 nm。

3 添加 22 µL Opti-MEM® 或 无血清培养基，通过涡旋混合反应以确保所有试剂完全混合。 混合后，离心并在室温下孵育 5 分钟（静置）。

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