细胞葡萄糖摄取检测试剂盒 Glucose Cellular Uptake Measurement Kit
细胞内葡萄糖吸收检测试剂盒
◆原理
胰岛素是降血糖的激素，它能够以脂肪细胞或者骨骼肌等为中心促进糖输送活性，将糖从细胞外吸收到细胞内。
测定糖的吸收量一般是使用3H标记的3-O-甲基-D-葡萄糖和2-脱氧葡萄糖（2DG）的方法。这种方法需要用同位素，所以只能在RI管理区域内使用，在一般的实验室也无法使用。
本试剂盒使用安全，操作简单，用non-RI法能够简便地测定细胞内糖吸收量。
试剂盒测定
细胞吸收的2DG会在己糖激酶的催化下会被2-脱氧葡萄糖-6磷酸（DG6P）氧化，不继续进行酶反应而是留在细胞内。
本试剂盒是在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）的酶反应下，生成2DG6P成比例地生成NADPH，然后NADPH发生氧化生成荧光基质后就可以测定荧光物质的荧光强度。
◆优点・特色
● 检测2-deoxyglucose (2DG) (葡萄糖类似物) 摄入的总量
● 葡萄糖，2DG被细胞摄取后，在己糖激酶作用下，迅速磷酸化为2-脱氧葡萄糖-6-磷酸（2DG6P）。
● 而2DG6P在细胞内聚集，不会发生进行代谢。
● 细胞裂解物中的2DG6P在耦合酶作用下，产生荧光信号，其强度与2DG6P的量正相关。
● 利用已知2DG6P的标准曲线，对照检测的荧光强度计算样品2DG水平
相关产品比较
| 【本试剂盒】
Measurement Kit, Broad Range, Fluorometric Cat. No. MBR-PMG-K01E |
【相关产品】
2-Deoxyglucose (2DG) Uptake Measurement Kit Cat. No. CSR-OKP-PMG-K01E |
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| 测定方法 | Non-RI法 | Non-RI法 |
| 操作时间 | 3小时 | 5~7小时（2天） |
| 检测方法 | 荧光（Ex 540 nm/Em 590 nm） | 发光（420 nm） |
| 特征 | 测定范围广（0~50 μm）能够迅速进行测定
可以使用高通量法一步测定 |
高 |
◆案例・应用
试剂盒组成
| 试剂 | 规格 | 数量 | 储存（开封后） |
| 2DG6P Solution (1 mM) | 500 μL | 3×3 mL | -20°C
(避光) |
| Sample Diluent Buffer Concentrate (100x) | 5 mL | 1 vial | |
| Substrate Buffer | 9 mL | 1 vial | |
| Fluorescent Substrate | 120 μL | 1 vial | |
| Enzyme Solution | 270 μL | 1 vial |
该试剂盒可进行100次反应
该试剂盒可进行100次反应
需要准备：
● 超纯水（蒸馏水）
● 2-deoxyglucose 建议产品
● 牛血清白蛋白建议产品
● 96-well黑色多孔板
● 96-well荧光酶标仪 （激发波长540 nm/荧光波长590 nm）
● 超声波细胞裂解装置
胰岛素刺激3T3-L1细胞分化后2DG的摄取情况
※具体操作见“相关资料”
胰岛素刺激3T3-L1细胞分化及样品制备
对于您实验的细胞，需要根据细胞本身的情况优化培养基和各项条件，如实际浓度、培养时间及其他实验相关参数。
以下是标准12孔培养板的3T3-L1细胞操作步骤。
试剂和培养基
･Serum-free culture medium
･Krebs Ringer Phosphate HEPES (KRPH) buffer at 37°C
(1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 1.3 mM CaCl2, 118 mM NaCl, 5 mM KCl, 30 mM Hepes, pH7.5)
･BSA (essentially fatty acid free and globulin free grade, use Sigma Ca. No. A0281 or equivalent)
･2-Deoxy-D-glucose (2DG) solution
･ Insulin solution
･ PBS(-)
･Phloretin or Cytochalasin B (or other glucose uptake inhibitor)
细胞样品制备
1) Differentiate 3T3-L1 cells to adipocytes in a 12-well culture plate.
2) Replace culture media with serum-free medium. Return to incubator for 6 hours.
3) Gently wash cells 3 times with 1.5 mL of warm KRPH buffer without BSA?.
4) Gently add 3 mL of warm KRPH buffer containing 2% BSA.
加入胰岛素
5) For this example, insulin is added to a final concentration of 1 μm .
6) Incubate cells for 18 min at 37°C.
加入2DG
7) For this example, 2DG is added to a final concentration of 1 mM.
8) Incubate cells at 37°C for 20 minutes.
9) Wash cells gently 3× with cooled PBS containing 200 μM Phloretin to inhibit further 2DG uptake.
细胞裂解及样品制备
10) Add 1.5 mL of 1× Sample Diluent Buffer.and lyse cells by sonication with a microtip sonicator.
11) Collect cell lysate to tube, and apply heat treatment at 80°C for 15 minutes.
Note: Do not add protease inhibitors to cell lysates.
Note: If an alternate method for cell lysis will be used, do not use NaOH as NaOH degrades 2DG6P.
12) Centrifuge lysates at 15000 x g for 20minutes at 4°C
13) Transfer cell lysate supernatants to a fresh tube. These cell lysate supernatants are your experimental samples.
Note: Supernatants can be stored at -20°C for later analysis.
检测细胞裂解液中的2 DG
14) Follow the procedure of [Section III-1] “2DG Measurement Protocol” above.
【参考文献】
| [1] | Yamamoto N, et al ,(2006). A nonradioisotope, enzymatic assay for 2-deoxyglucose uptake in L6 skeletal muscle cells cultured in a 96-well microplate. Anal. Biochem. 351: 139-145. |
| 产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品等级 |
| CSR-MBR-PMG-K01E | Glucose Cellular Uptake Measurement Kit (Broad Range, Fluorometric)
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