中性蛋白酶（Neutral protease），商业名称Dispase II，也称分散酶II，普遍用于不同组织和器官中的细胞分离。Dispase II是一种非特异性金属蛋白酶，能快速有效且温和的破坏组织细胞外基质释放单细胞培养物（原代细胞培养物）或收集已培养的细胞将其转移到新的培养基质上（传代培养）。另外，还能预防悬浮细胞培养过程中发生的成团现象。Dispase II极其稳定，不会受温度、pH和血清内容物的干扰；通过螯合剂或稀释很容易失活；酶活温和，对细胞损伤小，可良好维持细胞膜完整性。

本品来源于多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa），无支原体或其他动物病毒污染。以非无菌的冻干粉形式提供，比活力≥0.8 U/mg蛋白，使用前需进行除菌。常用工作浓度范围为0.6-2.4 U/ml。

产品特性

1）  EC NO：3.4.24.4

2）  同义名：Neutral protease中性蛋白酶

3）  比活力：≥0.8 U/mg protein (37℃, casein as substrate, pH 7.5)

4）  酶活力单位定义：在37℃，pH 7.5的反应条件下，1min内释放福林酚阳性反应氨基酸和多肽量相当于1 μmol (181 μg)酪氨酸所需的酶量即为一个活力单位。

5）  最佳pH：6.0 – 8.5

6）  激活剂：最佳Ca2+为2mM，该酶已含足量Ca2+确保最佳酶活力。

7）  抑制剂： EDTA, EGTA, Hg2+,以及其他重金属。该酶活性不受血清干扰。

保存与运输方法

保存：2-8℃干燥保存，至少1年有效。

运输：冰袋运输。

使用方法

一、储存液和工作液制备

1）储存液制备：用Hepe缓冲盐溶液（50 mM Hepes/KOH pH7.4, 150 mM NaCl）溶解Dispase II冻干粉，配制成10mg/ml的储存液，用0.22µM滤膜过滤除菌。本储存液置于2-8℃，2周稳定；根据单次用量分装冻存，高达2个月稳定，避免反复冻融。

2）工作液制备：使用时用合适的细胞培养液将储存液稀释到工作液浓度即可，常用工作浓度为0.6-2.4 U/ml。不推荐使用>2.4 U/ml的工作浓度。具体使用浓度请根据自身实验体系或参考文献来调整。

二、组织分离

1）用无菌手术刀或剪刀将组织切成3-4mm小片，之后用无菌PBS缓冲液清洗组织片几次；

2）用Dispase II工作液（0.6-2.4 U/ml）浸没并37℃孵育进行组织解离；

3）置于水平摇床上，低速转动，37℃孵育直至组织完全解离；【注意】：第一次使用Dispase II，通过细胞计数来确定总反应时间。对于坚硬致密组织需要1h的孵育时间，不过孵育时间几小时也不会有副作用。

4）若有需要，将消化产物用无菌不锈钢网过筛，从而分离解散细胞和残留组织，或当更大片段组织静置到管底，轻轻倒出上层细胞。若需要进一步解离，则加入新鲜的Dispase II工作液到残留组织。

5）低速离心收集细胞，吸掉酶工作液；

6）用适当的细胞培养液重悬细胞，置于正常预优化条件下培养。

三、细胞亚培养

1）用37℃预热的Dispase II工作液完全覆盖细胞，置于37℃孵育5min；

2）吸掉溶液，于37℃再孵育10min；

3）显微镜观察以确定消化情况，若有需要，可再孵育15min；

4）用细胞培养液重悬细胞，低速离心并用培养基清洗细胞几次；

5）用新鲜细胞培养液重悬细胞；

6）按照常规方法进行分盘传代。

注意事项

1）Dispase是Godo Shusei Co., Ltd.的注册商标。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。