Agrobacterium rhizogenes发根农杆菌;pCAMBIA2301;Streptomycin链霉素;Rifampicin利福平;
产品名称 | 规格 | ||
Electrocompetent Cell农杆菌电转感受态细胞 | 10×50μl | ||
Electrocompetent Cell农杆菌电转感受态细胞 | 50×50μl |
菌株描述
发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是根瘤菌科农杆属的一种革兰氏阴性土壤细菌,能够侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。起关键作用的是其携带的Ri质粒,含有负责发根自主性生长和冠瘿碱合成的基因。结构上于Ti质粒类似,主要有致毒区(Vir),T-DNA区以及冠瘿碱合成功能区等。
根据合成冠瘿碱的不同,Ri质粒分为4种类型:1)甘露碱型;2)黄瓜碱型;3)农杆碱型;4)米奇矛型。
发根农杆菌菌株K599(NCPPB2659)含有pRi2659农杆碱型Ri质粒,具有广泛的宿主范围(葫芦科,豆科,茄科等),同时具有链霉素抗性。
产品包装
组分名称 | 货号(规格) | ||
K599 Electrocompetent Cell | 10×50μl | 50×50μl | |
pCAMBIA2301 Control Vector (10ng/μl) | 10μl | 10μl |
保存与运输条件:
保存:-80℃保存,1年有效。
运输:干冰运输。
注意事项
1) 感受态细胞应保存在-80℃,不可反复冻融和放置时间过长,以免降低感受态细胞的转化效率。
2) 整个转化操作,严格根据相应温度及无菌条件要求进行。
3) 加入质粒的体积不应大于感受态体积的1/10。质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,会导致转化效率急剧下降。质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。
4) 为确保最高转化效率,整个操作过程应尽量轻柔,并保持低温。
5) 电转感受态细胞中不可混入气泡,转化高浓度的质粒可相应减少最终涂板用量。
6) 平板上克隆密度过大时,由于营养不足,克隆生长变慢,菌落变小。为获得大菌落,应减少质粒用量。
7) K599具链霉素抗性,不可用于具链霉素抗性质粒的转化。
8) 为了保证最佳的转化效率,发根农杆菌的培养务必使用TY培养基(配方见附表1)。
9) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
1) 将0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净吸水纸上5min,待其沥干水分,正置5min,使乙醇充分挥发干净,立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖,冰中静置5min使其充分降温。
2) 取-80℃保存的农杆菌感受态细胞插入冰中5min,待其完全融化。
3) 往50μl感受态细胞悬液中加入0.01~1μg(体积不大于6μl)质粒DNA,用手拨打管底使其混匀,立即插入冰中。用枪轻轻吹打混匀感受态细胞-质粒之后快速转移到电击杯中,盖上杯盖,空管保留待用【注意:质粒DNA最好用试剂盒抽提,且用双蒸水溶解。由于感受态转化效率较高,第一次使用最好做预试验确定最佳的质粒用量】。
4) 启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 ohm,V=2400 V(此参数参考Bio-rad,具体使用请参考电转仪推荐步骤来操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中。
5) 加入1ml无抗生素的TY并转移到感受态空管中,于28℃振荡培养2~3h。
6) 6,000rpm离心1min,留取100ul左右上清,之后用枪轻轻吹打重悬菌体。之后加到含相应抗生素的TY平板上,用无菌玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。室温正置10 min,待液体被吸收后,倒置平板,28℃培养2-3天。
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附表1固体和液体TY培养基配方
组分Component | TY(液体)/升 | TY(固体)/升 |
胰蛋白胨Tryptone | 5g | 5g |
酵母提取物Yeast extract | 3g | 3g |
琼脂Agar | / | 15g |
补水到1L,121℃,20min高压灭菌 | 补水到1L,121℃,20min高压灭菌 | |
氯化钙CaCl2 | 配制1M CaCl2水溶液,121℃,20min高压灭菌。之后按照10ml/L加入上方灭菌的液体营养液。 | 配制1M CaCl2水溶液,121℃,20min高压灭菌。之后按照10ml/L加入上方灭菌的液体营养液。 |
附表2常见发根农杆菌对抗生素敏感性总表
农杆菌菌株 | 羧苄(carb) | 链霉素(strep) | 利福平(rif) | 庆大霉素(gent) | 卡那霉素(kan) |
Ar A4 | S | S | S | S | R |
Ar Qual | S | R | S | R | S |
Ar 1193 | R | R | R | S | S |
K599 | S | R | S | S | S |
C58C1 | S | R | R | S | S |
MSU440 | S | R | S | S | S |
【备注】:S代表敏感,R代表抗性。 |
附表3常见农杆菌抗生素配制方法
抗生素 | 配方 | 母液 | 工作液 |
羧苄青霉素 | 去离子水溶解,0.22μm滤膜除菌 | 50mg/ml | 50μg/ml |
硫酸卡那霉素 | 去离子水溶解,0.22μm滤膜除菌 | 50mg/ml | 50μg/ml |
链霉素 | 去离子水溶解,0.22μm滤膜除菌 | 10mg/ml | 50μg/ml |
庆大霉素 | 去离子水溶解,0.22μm滤膜除菌 | 20mg/ml | 40μg/ml |
利福平 | DMSO溶解,0.22μm有机相滤膜除菌 | 10mg/ml | 20μg/ml |
氯霉素 | 无水乙醇溶解,0.22μm有机相滤膜除菌 | 34mg/ml | 34μg/ml |