Rhod-4, AM 红色钙离子探针; Rhod-2 AM钙离子荧光探针；Fluo-8； Fluo-4； HTS Screen Assay高通量筛选；
Rhod-2虽然是最受欢迎的红色荧光Ca2+荧光探针，但Rhod-2的线粒体定位和细胞中高基底Ca2+信号使其在某些细胞应用中严重受限制。另外，Rhod-2在488nm处很不理想的激发波长使其在某些只有488nm激发光源的仪器比如FLIPRTM上信号很弱。Rhod-4正是根据这些缺陷而改进的，具有以下特征：
1） Rhod-4的最大激发和发射波长是530nm和555nm。虽Rhod-4最大激发波长是530nm，但在488nm处
激发下的信号也相当强（见Fig 1）。除了能在514nm，532nm和546nm的长波长激发之外，Rhod-4用氩离子激发器在488nm激发下也能得到理想的荧光信号。Rhod-4随着增加的Ca2+浓度荧光信号而增强（555nm发射波长），一旦与Ca2+结合荧光约增强＞200倍。由于许多细胞受刺激后的Ca2+浓度提高通常是5~10倍，因此，Rhod-4是一款优秀的检测此范围内Ca2+浓度变化的高灵敏探针。
Fig 1, Rhod-4钠盐在含氯化钙体系内的激发光谱特征。
2） 一旦受激动剂刺激后，Rhod-4在细胞内的荧光明显强于Rhod-2（信噪比）。更重要的是，Rhod-4主要定位在细胞胞浆内，不像Rhod-2主要定位在线粒体。另外，Rhod-4具更低的温度依赖性的细胞加载特性，不管室温还是37℃产生相似的结果。这一特征使Rhod-4比Rhod-2在HTS应用中更有优势。
Rhod-4, AM是Rhod-2的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内，即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Rhod-4，从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。本品以冻干粉的形式提供，使用时只需经无水DMSO充分溶解，配置成2~5mM的储存液，并依据具体实验和相关文献资料调整到需要的工作浓度即可。
基本特性
1） 同义名：Rhod-4, Acetoxymethyl Ester
2） 分子量：1015.96
3） 外观：红色固体
4） 最大激发/发射波长：530/555 nm
5） Kd（Ca2+结合）：525NM
6） 溶解性：溶于DMSO（2~5mM）
保存与运输方法
保存：-20℃干燥避光保存，至少一年有效。
运输：室温运输。
注意事项
1） 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
2） 乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。
3） Rhod-4, AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可在20-25℃温育片刻至全部融解后使用。
4） Rhod-4, AM第一次使用，建议储存液现配现用，分装成单次用量，严格做到≤-20℃密封干燥冻存，以防止受潮。为了保证良好的实验效果，尽量在短时间内使用。
5） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
【注意】以下使用方法仅用作参考，可根据具体的实验条件做出调整。
A， 试剂准备
1） 配制Pluronic F-127母液：称取100mg Pluronic F-127粉末（货号：MS4301-1G）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。
2） HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3) 或者其他生理缓冲液
B，操作步骤
1） 用无水DMSO溶解Rhod-4, AM配制成2-5mM的储存液，或将已配好的Rhod-4, AM储存液取出于室温回温。（如：若配制成4mM的母液，需向50µg Rhod-4, AM中加入12.3µl 无水DMSO）。准备Rhod-4, AM工作液之前，有时需要往Rhod-4, AM储存液中加入适量的20% Pluronic F-127溶液，以增强AM探针的水溶性。
【注①】：Rhod-4, AM染色工作液制备前，添加等体积20% Pluronic F-127溶液到Rhod-4, AM+DMSO储存液，从而使Pluronic F-127的最终工作浓度约为0.02%。
【注②】：Pluronic F-127可以防止AM探针在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但Pluronic F-127可降低AM探针的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议加入储存液长期保存。
2） 用HHBS或其他生理缓冲液将 Rhod-4, AM+DMSO储存液稀释到1-10µM的工作液。
【注①】：Rhod-4,AM应用在大部分细胞的推荐加载浓度为4-5µM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。
【注②】：Rhod-4, AM工作液需现配现用，避免反复冻存。
3） 【可选】如果细胞内含有机阴离子转运体，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入细胞培养基内，以降低去酯化探针的泄露水平。
【注①】：丙磺舒或磺吡酮储存液相当偏碱，因此加入培养基后需要重新调整pH。
4） 将准备好的Rhod-4, AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。室温或37℃孵育30min-1h。
【注①】：若使用含血清的培养基，血清内酯酶会降解AM，从而降低Rhod-4, AM加载效果。而含酚红培养基会使本底值略偏高，建议加入染色工作液前，对细胞清洗2~3次。
【注②】：关于孵育的时间，如果首次做实验不能确定，建议先孵育30min，看荧光效果；如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。
【注③】：降低探针加载温度可能会降低探针的区室化现象。
5） 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理缓冲液（如有必要，使用含转运体抑制剂如2.5mM丙磺舒的缓冲液）清洗细胞1~2次，以去除残留探针。
6） 室温再孵育30min以保证细胞内AM的完全去酯化。
7） 用适当的仪器如激光共聚焦、流式细胞仪、荧光酶标仪，以及波长Ex/Em=530/555 nm来进行检测。
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