1）吲哚啉环氮原子上取代基引入乙氧基，结构同Amershan Pharmacia的花菁类染料，应用于基因芯片的双色荧光检测。结构同美国化学会注册CAS号对应结构。乙氧基形式的花菁类染料比甲基形式（比如Lumiprobe公司）表现出更好的光稳定性，色牢度，且能更好的防止染料自聚。

2）从化学合成和分离纯化角度来看，乙氧基形式的花菁类染料比甲基形式要求更高，合成难度更大，成本也随之提高，但我司在保质的基础上仍以更有竞争力的价格提供此系列的花菁类染料，欢迎所有科研用户使用我司的产品。

3）可接受定制包装业务。25mg，100mg，500mg，1g，5g………。

产品描述

花菁类染料（Cyanine Dyes）是一种在两个氮原子间含聚亚甲基桥键且携带一非定域电荷的分子【见下图】。 

归其结构特征，花菁素具有极其高的消光系数通常高于100,000 L⋅mol-1⋅cm-1。不同的替代基允许控制发光团的性能比如吸光波长，光稳定性和荧光强度。例如，通过选择不同长度的聚亚甲基桥键能够控制吸光和荧光波长：花菁素越长，吸光和发射波长更高，高达至近红外区。

在生命科学领域广受欢迎的花菁类染料由美国卡耐基梅隆大学（CMU）的Alan Waggoner教授和同事于二十世纪90年代早期研发应用。这些染料呈现出低的生物分子非特异性结合，并由其巨大的消光系数和良好的量子产量产生明亮的荧光。目前商业化可提供各种反应性衍生物，比如点击化学用的N-羟基琥珀酰亚胺酯，马来酰亚胺，叠氮化物和其他衍生物。目前花菁染料常以两种异构体的形式供应：一种非磺化的花菁类染料和磺化的花菁类染料，对于许多应用，两种是可以互相替换的，因其光谱属性基本相同。两种染料都可用于DNA和蛋白质等生物分子的标记。两者的区别在于溶解度：磺化染料具水溶性，可以在水环境中标记，无需有机共溶剂，且在水中不易聚集。

Cyanine5是一种脂溶性的，红色发射波长的荧光染料，与各种仪器兼容，包括许多荧光显微镜、成像仪、扫描仪和荧光酶标仪。Cyanine5 NHS Ester是Cyanine5的胺反应活化酯，用于标记多肽、蛋白和寡核苷酸的氨基基团，其标记体系内需要少量的有机共溶剂（比如DMF和DMSO）。Cyanine5 NHS Ester非常适用于低成本标记可溶性蛋白以及各种多肽和寡核苷酸。也适用于有机溶剂内对小分子的标记。对于要求更严格的靶标比如易降解蛋白，当反应体系不能使用DMF或DMSO时，建议使用水溶性的Sulfo-Cyanine5 NHS Ester（Cat#：MX4657-1MG）。

产品特性

1）CAS NO：N/A
2）同义名：Cyanine5 NHS ester; Cy5 NHS ester; Cy5 SE; Cyanine5 N-hydroxysuccinimide ester; Cy5琥珀酰亚胺酯；Cy5 NHS酯；
3）纯度：≥95%
4）外观：深蓝色粉末或固体
5）溶解性：溶于DMF，DMSO，几乎不溶于水
6）Ex/Em：~646/664 nm
7）消光系数：250, 000 L⋅mol-1⋅cm-1
8）光谱相似染料：Alexa Fluor® 647, DyLight™ 649

保存与运输方法

保存：-20°C避光干燥保存，2年有效。

运输：室温运输。

注意事项

1. Cyanine5 NHS Ester是脂溶性的，先用有机溶剂如DMSO，DMF配制成母液后，再加入水溶性反应溶液内。纯有机溶剂的母液置于-20℃避光保存，最好2周内用完，避免反复冻融。水溶性反应液必须现配现用，尽快用完。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

【注意】：Cy染料和生物分子的比例（F/P）=4~12之间荧光强度最高。F/P过高，荧光探针会自我淬灭并且影响生物分子的活性。CyDye NHS在pH 8.5~9.4内标记抗体10min，F/P可达5~6。但在pH 7.0内几乎无反应。我司内部使用Cy3NHS标记Anti-GST抗体发现按1:1，1:5，1:10，和1:20标记得到的F/P分别为0.28:1，1.16:1，2.3:1和4.6:1。

1. 水溶性Cy3NHS标记Anti-GST抗体【其它CyDye NHS参考此方法进行并做适当摸索】

商业化购买的抗体如果含有其他蛋白（如血清白蛋白，明胶等），或溶于带氨基的缓冲液，会影响标记。需在标记前对抗体进行纯化。

1. 1. 于1L 0.15M NaCl溶液中透析Anti-GST（0.5ml，3mg/ml），室温或4℃透析4h。
   2. 换用1L新鲜的0.15M NaCl溶液，4℃透析过夜。
   3. 第二天再换用1L 0.1M NaHCO3（pH 8.3），4℃透析4h。
   4. 【可选】用0.22μm低吸附滤膜过滤透析后的抗体溶液。
   5. 用0.1M NaHCO3（pH 8.3）稀释少量的抗体，于280nm测其紫外吸收值并计算标记抗体的总量（IgG抗体摩尔吸光系数为170,000 at 280nm）。
   6. 用DMSO配制Cy3 NHS（Mw:765.95），浓度为10mg/ml。根据CyDye NHS和抗体的使用比值（比如1:20）来计算所需要染料的体积。然后慢慢将其加入到抗体溶液中，同时于暗处低速搅拌，室温45min。
   7. 用1L 0.15M NaCl溶液，常温或4℃避光透析4h，以除去未标记上的Cy3 NHS。
   8. 换用新鲜的1L 0.15M NaCl溶液，4℃避光透析过夜。
   9. 换用1L 0.01M PBS/0.01% NaN3溶液室温或4℃避光透析4h，然后在4℃避光再次透析过夜。
   10. 【可选】用0.22μm低吸附滤膜过滤透析后的抗体溶液。
   11. 用0.01M PBS/0.01% NaN3溶液整数倍稀释标记抗体，测定280nm（蛋白）和552nm（Cy3）处的紫外可见吸光度。
   12. 产品冷冻干燥成粉末或置于0.01M PBS/0.01% NaN3溶液中，-20℃避光保存。

【F/P计算】：

Cy3在552nm下的摩尔吸光系数为150,000L⋅mol-1⋅cm-1，此蛋白在280nm的摩尔吸光系数为170,000 L⋅mol-1⋅cm-1，不同蛋白的摩尔吸光系数不同。Cy3本身在280nm处的吸收是552nm处的8%。按照以下公式计算F/P值。

[Cy3] = A552/150000; [Antibody] =[A280-(0.08×A552)]/170000

F/Pfinal =[Cy3]/ [Antibody]= [1.13×A552]/[A280-(0.08×A552)]

1. 水溶性Cy5 NHS标记（D-ser2）- Leu-Enkephalin【其它CyDye NHS参考此方法进行并做适当摸索】

1. 低温保存的Cy5 NHS置于室温回温至少20min。往1mg粉末内加入400μl高品质无水DMSO充分溶解。同样，低温保存的玻璃瓶装的（D-ser2）- Leu-Enkephalin（YSGFLT，0.75mg）室温回温后加入400μl高品质无水DMSO充分溶解。将400μl Cy5 NHS加入400μl多肽内。【染料与多肽通常质量比1:1】。
2. 再加入15μl三乙胺，常温避光搅拌反应混合物，过夜。【若多肽稳定性较弱，则于4℃反应过夜】。
3. 用HPLC纯度多肽。使用C18柱子（25cm×10mm），每次上样注入2×400μl，30min梯度洗脱从0.1% TFA水溶液到MeCN:H2O (0.1% TFA)=70：30，流速4ml/min。（对不同的多肽选择不同的合适HPLC梯度流动相）
4. 收集适当的色带峰，标记多肽的保留时间比未标记的多肽长。
5. 产品冷冻干燥成粉末或置于水溶液中，-20℃避光保存。必要时可用质谱表征。
6. CyDye标记的蛋白/多肽稳定性取决于蛋白本身。例如标记的IgG在4℃可避光保存2月，更长保存需加入等体积甘油-20℃避光保存。

【F/P计算】：

Cy5在650nm下的摩尔吸光系数为250,000L⋅mol-1⋅cm-1，此蛋白在280nm的摩尔吸光系数为170,000 L⋅mol-1⋅cm-1，不同蛋白的摩尔吸光系数不同。Cy5本身在280nm处的吸收是650nm处的5%。按照以下公式计算F/P值。

[Cy5] = A650/250000; [Peptide] =[A280-(0.05×A650)]/170000

F/Pfinal =[Cy5]/ [Peptide]= [0.68×A650]/[A280-(0.05×A650)]

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