为满足研究者研究活细胞内溶酶体生成和功能的动力学特征，特此开发Lysosensor探针，一种区分酸性细胞器的荧光pH指示剂。该系列染料属于向酸性探针，由于质子化聚集在酸性细胞器上。这一质子化也使得因弱碱性侧链而封闭荧光的探针得以荧光释放，促使荧光信号增强。因此，LysoSensor探针遇酸后荧光信号呈现pH依赖性的增强。

LysoSensor Yellow/Blue DND-160（黄/蓝色溶酶体探针）是一种独特的比率型探针，呈现pH依赖性的双激发和双发射光谱峰（见Fig 1）。然而，活细胞中这一探针仅呈现pH依赖的双发射光谱（发射波长比率~450/510nm，激发波长~365nm）。在酸性细胞器中，LysoSensor Yellow/Blue DND-160主要呈现黄色荧光，而在酸性偏低的细胞器中具有蓝色荧光。双发射波长的测定允许比率成像分析在酸性细胞器比如：溶酶体或精子顶体内的pH。其pKa值约为4.2。LysoSensor Yellow/Blue DND-160，常常简写成PDMPO，普遍用作海洋硅藻中二氧化硅沉积和运输的一种示踪剂。

Fig 1. LysoSensor Yellow/Blue DND-160的pH依赖性光谱反应图（A）荧光激发光谱（B）荧光发射光谱。

本品为DMSO储存液，浓度为1mM。用于活细胞的溶酶体染色，建议工作浓度为≥1µM，需根据实际情况做优化调整。

产品特征

1） 外观：溶液

2） 浓度：1mM in DMSO

3） 亚细胞定位：溶酶体

4） 颜色：黄色、蓝色

5） 检测仪器：荧光显微镜

6） Abs（nm）：329，384nm[最大双吸收波长，对pH敏感，见Fig 1]

7） Em（nm）：440，540nm [最大双发射波长，对pH敏感，见Fig 1]

保存与运输方法

保存：≤-20ºC避光干燥保存，收到货至少12个月有效。 

运输：冰袋运输。

注意事项

1） 整个染色过程中需注意避光。

2） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简单低速离心使溶液降至管底。第一次使用请将本品按单次用量分装保存，≤-20°C避光干燥保存，尽量避免反复冻融。最佳工作浓度需根据不同的实验要求、细胞类型、细胞或组织的膜通透性等进行优化。

1. 工作液的配制
利用生长培养基或合适的缓冲液将1mM储存液稀释至工作浓度，工作液需现配现用。对于Lysosensor系列溶酶体探针，推荐工作液浓度≥1µM；

【注意】：

1）为了降低探针加载过度可能引起的假阳性，建议在不影响染色效果的情况下尽量使用低浓度。

2）若细胞在染色后于不含染料的培养基中孵育，会观察到荧光信号的衰减和细胞的空泡化现象。

2.染色步骤（贴壁细胞）

1）将细胞置于培养皿中的盖玻片上，加入合适培养基，使其爬片生长。
2）待细胞生长到合适密度，吸除培养液，加入适量37℃预热的含探针培养基（必须完全覆盖住细胞），在适合特定细胞类型的生长条件下孵育细胞30min-2h（具体孵育时间需根据细胞类型而定）。
3）利用不含探针的新鲜培养基替换上述染色液，并且用装有合适滤片的荧光显微镜进行观察。若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间，使得染料能聚集在溶酶体上。

3.染色步骤（悬浮细胞）
1）离心沉淀细胞，吸除上清。
2）利用适量 37℃预热的含探针培养基重悬细胞，在适合特定细胞类型的生长条件下孵育细胞30min-2h（具体孵育时间需根据细胞类型而定）。

3）离心，吸除染色液，加入新鲜培养基重悬细胞。
4）用装有合适滤片的荧光显微镜进行观察。若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间，使得染料能聚集在溶酶体上。

【注意】：

另一种方法，悬浮细胞可能会粘附到经BD Cell-Tak处理的盖玻片上，此时，可用类似于贴壁细胞的方法进行染色。

附录I 溶酶体探针总表

	名称	Abs (nm)[1]	Em(nm)[1]	pKa
	LysoTracker Blue DND-22蓝色	373	422	N/A
	LysoTracker Green DND-26绿色	504	511	N/A
	LysoTracker Red DND-99红色	577	590	N/A
	LysoTracker Deep Red远红	647	668	N/A
	LysoSensor Yellow/Blue DND-160黄/蓝色	329，384[2]	440，540[2]	4.2
	LysoSensor Green DND-189绿色	443	505	5.2
[1]:在水溶性缓冲液或甲醇中测定的最大吸收和发射波长；在细胞环境内数值可能会有些许差异。[2]:最大双吸收和发射波长，对pH敏感

溶酶体系列探针常见问题

1. 如何选择合适的溶酶体探针？

答：对于溶酶体定位实验，请选择Lysotracker系列探针，根据自身的实验体系，结合lysotracker系列探针的荧光特征，选择合适激发和发射波长的荧光探针。Lysotracker Blue DND-22（MX4320-50UL）探针的光量子产率偏低，建议在非荧光选择受限的情况下，推荐选择其他几款Lysotracker探针。对于酸性细胞器（比如溶酶体）的pH测定实验，请选择Lysosensor系列探针。

2. 溶酶体探针染色后是否能做固定？

3. 溶酶体探针是否能用于流式分析和荧光光度计分析？

4. 溶酶体探针LysoTracker Green DND-26（MX4318-50UL） 和LysoSensor Yellow/Blue DND-160

（MX4316-50UL）的建议孵育时间多少？