Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-APC/7-AAD Apoptosis Detection Kit）是一款用来检测细胞凋亡的试剂盒，可以用流式细胞仪进行检测。本试剂盒包含APC标记的Annexin V，用来检测早期细胞凋亡；以及7-氨基放线菌素D（7-AAD），用来检测坏死细胞。

本试剂盒的工作原理在于：磷脂酰丝氨酸（Phosphotidylserine，PS）是一种带负电荷的磷脂。正常细胞中，PS位于细胞膜内面，但当凋亡开始后，PS在磷脂双分子层中的不对称分布逐渐消失并转移到细胞膜表面，从而暴露在细胞外环境中。膜联蛋白V（Annexin V）是一种分子量约35kDa的钙离子依赖性磷脂结合蛋白，能非常容易的结合PS，且具有高度的亲和性。因此，通过Annexin V与PS的结合与否来判断凋亡发生。另外，7-AAD的引入能辅助区分凋亡早期细胞和晚期凋亡或坏死细胞。7-AAD作为一种活细胞排斥探针，不能穿透具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡早期细胞，但能穿透丧失细胞膜完整性的凋亡晚期细胞或坏死细胞，从而将细胞核染红。因此，将Annexin V-APC与7-AAD联合使用时，呈现结果为：正常细胞（Annexin V-APC-/7-AAD-），早期凋亡细胞（Annexin V-APC+/7-AAD-）；晚期凋亡细胞和坏死细胞同时呈现双阳性（Annexin V-APC+/7-AAD +）。

产品组成

保存与运输方法

保存：2-8℃保存，不可冰冻。其中组分A，B需避光保存。1年有效。

运输：冰袋运输。

注意事项

1） 对于贴壁细胞，需要很好掌控消化步骤。细胞凋亡诱导时贴壁细胞如有漂浮细胞，需同时收集漂浮细胞和贴壁细胞合并染色。处理贴壁细胞时要小心，尽量避免人为造成的细胞损伤。胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，导致7-AAD摄入过多；而胰酶消化时间过长，细胞膜也易造成损伤，甚至会影响细胞膜PS与Annexin V的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接触，之后倒掉大部分胰酶，利用残留的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。消化液中尽量不用EDTA，EDTA会影响Annexin V与PS的结合。

2） 实验中不建议固定细胞，因固定过程可能导致荧光淬灭。

3） 由于细胞凋亡是一个快速过程，染色后请尽快检测，时间过长会导致凋亡或坏死细胞数量增加。

4） 若样品来源于血液，务必先去除血液中的血小板。因为血小板含有PS，会与Annexin V结合产生假阳性。可使用含EDTA的缓冲液并低速离心去除血小板，之后再用Annexin V binding buffer清洗细胞，以避免残留的EDTA螯合钙离子。

5） 荧光物质易发生淬灭，试剂储存和操作过程中尽量避光。荧光检测时也尽量缩短观察时间。

6） 7-AAD为潜在致癌物，操作时请做好防护措施，避免与皮肤、眼睛的直接接触。

7） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、 试剂准备

1× Binding Buffer的准备：取足量5× Binding Buffer用去离子水稀释到1× Binding Buffer（比如，1ml 5× Binding Buffer加4ml去离子水稀释），混匀均匀，4℃或冰上预冷待用。

1×PBS的准备：自行配制或直接购买商业化的PBS Buffer。4℃或冰上预冷待用。

二、 仪器参数校正

2.1 收集1-3×106个细胞，用1×PBS离心清洗2次，弃上清。

2.2 加入500μl Apoptosis Inducer Control重悬细胞，于冰上孵育30min。

2.3 加入1×PBS离心清洗1次，弃上清。

2.4 加入适量1× Binding Buffer重悬，并加入等量且未经处理的活细胞，轻轻混合。用1× Binding Buffer补充至1.5ml，等分成3管，其中1管为空白对照管，另2管为单染管。

2.5 单染管分别加入5μlAnnexin V-APC或10μl7-AAD，室温避光孵育15min。

2.6 在流式细胞仪上，用空白管调节前向散射光（Forward Scatter,FSC）、侧向角散射光（Side scatter ,SSC） 和荧光通道的电压，并在此电压条件下，用单染管调节荧光通道的补偿。

三、 染色步骤

3.1 细胞样品的准备：

a）对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一干净离心管内备用。 用不含EDTA的胰酶消化细胞至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果无法完全离心至管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心速度。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。

b）对于悬浮细胞：1000rpm离心5min沉淀细胞。对于特定的细胞，如果无法完全离心至管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心速度。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。

3.2 用1× Binding Buffer重新悬浮细胞沉淀并调整浓度为1×106-1×107个细胞/ml。

3.3 取100µl的细胞悬液到5ml流式管中，加入5µl Annexin V-APC和10µl7-AAD混匀，室温避光孵育15min。

3.4 无需清洗，每管加入385µl1× Binding Buffer，混匀，尽快（＜1h）用流式细胞仪完成检测。

四、染色检测

对于Annexin V-APC（Ex=633nm，Em=660nm），用流式细胞仪的FL4通道检测；对于7-AAD-DNA复合物（Ex=546nm，Em=647nm；能被488nm激光器激发，最大发射波长为647nm），用流式细胞仪的FL3通道检测。