CFDA, SE；Calcein AM 钙黄绿素；Cell Division 细胞分化（分裂）；Fluorescein diacetate (FDA)；PKH26；CAS NO：150347-59-4；

CFDA SE细胞增殖与示踪检测试剂盒（CFDA SE Cell Proliferation and Cell Tracking Kit）是一款基于荧光探针CFDA, SE，用于细胞增殖检测和细胞荧光示踪的检测试剂盒。此方法目前广泛替代MTT法或者3H-胸腺嘧啶核苷掺入法（3H-thymidine incorporation）等细胞增殖检测方法。本试剂盒包含粉末形式的CFDA, SE探针，细胞培养级的溶剂，以及细胞标记液，使用方便，操作简单。按照每个样本的标记体积为1ml来算，我司（金畔生物）提供两种规格的试剂盒，分别可检测500个和1000个样品。

CFDA, SE，英文全名5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester，CAS NO. 150347-59-4，是一种稳定的、细胞膜渗透性的非荧光染料，由两个醋酸基团和一个琥珀酰亚胺酯（SE）官能团组成的一个荧光分子。一旦主动扩散进入细胞，其醋酸基团被胞内酯酶切割，生成荧光素酯CFSE。CFSE具有高度荧光，且能通过其琥珀酰亚胺酯基团共价结合到细胞内的蛋白氨基基团。正是这个共价偶联反应，CFSE能够极其长期的保留在细胞内，长达数个月。另外，归因于这一稳定连接，一旦染料进入细胞，不会转移到邻近细胞。无活力细胞仍然是非荧光。而活细胞一旦分化，CFSE能够很均匀的分散到子细胞中，每分裂一次子代细胞约能得到亲本细胞1/2的荧光强度，因此，通过流式细胞仪对荧光强度的检测，能够依次分选出未分裂细胞，分裂一次的细胞（1/2荧光强度），分裂两次的细胞（1/4荧光强度），分裂三次的细胞（1/8荧光强度），以及以此类推其他分裂次数的细胞。CFSE可以检测分裂多达8次或更多次数的细胞增殖。

CFSE广泛用于细胞增殖和体内细胞示踪研究。CFSE的最大激发和发射波长分别为492nm和517nm，标记细胞后呈绿色荧光。使用流式细胞仪检测可用FL1检测通道。也能用荧光显微镜观察，使用FITC滤片。

产品包装

编号	组分	保存方法	产品编号/规格
			500T	1000T
A	CFDA SE粉末	-20ºC避光保存	1管	1管×2
B	CFDA SE溶剂	-20ºC避光保存	1ml	1ml×2
C	细胞标记液（10X）	-20ºC~4℃保存	50ml×2	50ml×4

保存与运输方法

保存：-20ºC保存，开封前1年有效，其中组分A（CFDA SE粉末）需严格避光，组分B避免强光照射。

运输：冰袋运输。

注意事项

1） CFDA SE溶剂在低温（如4℃，冰浴）等条件下会凝固而粘在离心管底、管壁或盖子上，可将其置于25℃温育片刻直至全部融解后使用。

2） CFDA SE粉末经溶剂溶剂配制成储存液后一个月内用完最好，最多不超过三个月。因CFDA SE容易被水解，并在水溶液中变质。使用过程中尽量避免接触水。而在标记过程中接触到水是在允许范围内。

3） 荧光染料均存在淬灭问题，操作和储存过程中需注意避光，以减缓荧光淬灭。

4） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1. CFDA SE储存液（1000X）制备

a） 将低温保存的CFDA SE粉末置于室温回温至少20min，之后短暂低速离心，让所有粉末都掉落至管底。同时也提前将CFDA SE溶剂置于室温或25℃水浴片刻直至充分融解。

b） 吸取一定量CFDA SE溶剂（比如400μl）到CFDA SE粉末中，充分溶解，短暂低速离心，之后全部转移到剩下的CFDA SE溶剂中，混匀后，此即为CFDA SE储存液（1000X）。此配制过程需要避光。

c） 按照单次用量分装，用铝箔纸包好后，置于≤-20℃避光干燥保存，最好一个月内用完，最长不超过三个月。-70℃保存能适当延长保存周期。

2. CFDA SE标记液（1X）制备

准备适量无菌的细胞培养级去离子水，根据实验需要用量，配制适量的CFDA SE标记液（1X）。比如，取10ml 细胞标记液（10X），加入90ml 去离子水，充分混匀后，即得到CFDA SE标记液（1X），短期置于4℃保存，长期不用可置于-20℃保存。

3. 染色步骤

a） 室温300×g离心细胞5min，吸掉上清。

b） PBS或其他生理缓冲液清洗细胞以去除任何残留的血清蛋白。之后再同上离心吸掉上清。

c） 用1ml CFDA SE标记液（1X）重悬细胞，调整密度为1-5 x 106cells/mL，转移到15ml离心管内。

d） 用CFDA SE标记液（1X）将CFDA SE储存液（1000X）稀释到2X。比如，取2μl CFDA SE储存液（1000X）到1ml CFDA SE标记液（1X），混匀后即为CFDA SE储存液（2X）。

e） 将1ml CFDA SE储存液（2X）加入到步骤c）中含1ml 待标记细胞的15ml离心管内，轻轻混匀。

f） 37℃避光孵育15min。【具体的孵育时间可根据实际情况做适当调整，常用孵育时间10-30min。】

g） 立即加入10ml完全细胞培养液（含血清）来淬灭染色过程，室温颠倒几次混匀。

h） 室温离心去上清，再用5-10ml完全细胞培养液清洗一次。

i） 再加入5-10ml完全细胞培养液，37℃孵育5min，以促进CFDA, SE在细胞内的充分反应和未反应的CFDA, SE重新回到完全细胞培养液中。离心去上清，完成最后一次清洗。

j） 之后用完全细胞液重悬细胞，此时可用荧光显微镜（Ex/Em=492/517nm，FITC滤片）或流式细胞仪（FL1通道）来观察标记效果。或开始用药物刺激处理或继续常规培养。经适当时间后用流式细胞仪检测细胞增殖，或用于特定目的的细胞示踪。标记细胞也可用于活体动物的移植，并用荧光进行示踪。标记的细胞呈绿色荧光。

常见应用和数据示例：

根据荧光信号的稀释来检测细胞增殖和分化（示踪）（Cell proliferation and cell division by Dye Dilution Method），此方法主要用来体内外检测淋巴细胞（T细胞和B细胞）的增殖，也能用来检测NK细胞，成纤维细胞甚至细菌。也有用来研究可移植造血干细胞的增殖。

示例1（体外）.

Fig 1. Murine CD4+lymphocytes, labelled with CDFA-SE were cultured with antigen-presenting cells with different peptides to stimulate either the memory or the memory and naïve cells. Up to five cell divisions can be observed.

示例2（体内）.

Fig 2. Ability of CFSE-labeled ovalbumin (OVA)-specific T cell receptor transgenic CD8+ OT-I T cells, when adoptively transferred into C57BL/6 mice to respond to OVA, data shown 3 days after adoptive transfer. Left panel: CD8+, CD45.1+ OT-1 T cells in recipient mice. Right panel: CFSE proliferation profile. Note non-divided population of CD8+ T cells in recipient mice not receiving antigen (light grey histogram) and auto-fluorescence of non-labeled lymphocytes (dark grey histogram). The Figure depicts CD8+ T cells that have divided 1-6 times based on CFSE dilution peaks. [Quah BJ et al. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. 2010 Oct 12;(44).]

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	产品名称	规格
	CFDA SE Cell Proliferation and Cell Tracking Kit	500T
	CFDA, SE细胞增殖示踪荧光探针	5mg
	Calcein AM/PI Double Stain Kit活细胞/死细胞双染试剂盒	500T
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	PKH26 Red Fluorescent Probe for General Cell Membrane Labeling PKH26红色荧光探针（用于常规细胞膜标记）	100μl