Hoechst 33342/PI凋亡检测试剂盒，JC-1膜电位检测；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒；
Hoechst 33342/PI细胞凋亡双染试剂盒（Hoechst 33342/PI Double Stain Kit）是一种采用Hoechst 33342和碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）双染进行细胞凋亡与坏死分析的检测试剂盒。检测原理在于：Hoechst 33342是一种活细胞核染料，能穿透正常细胞以及凋亡细胞膜，与DNA结合（最大激发波长为350nm，发射波长为461nm），呈现蓝色荧光。当细胞发生凋亡，染色质发生固缩，染色后的细胞荧光比正常细胞明显增强。而PI是一种死细胞核染料，不能穿透细胞膜，对于具完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。但对于坏死细胞，由于膜的完整性丧失，PI能够穿透进入细胞，与DNA结合（最大激发波长为536nm，发射波长为617nm），呈现红色荧光。经Hoechst 33342/PI双染后，使用流式细胞仪或荧光显微镜检测，正常细胞为弱红色荧光+弱蓝色荧光；凋亡细胞为弱红色荧光+强蓝色荧光；坏死细胞为强红色荧光+弱蓝色荧光。
本试剂盒可检测100个样品，每个样本的细胞数量可为0.1~1×06。
产品包装
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编号 |
组分名称 |
规格 |
保存方法 |
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A |
Cell Stain Buffer 细胞染色缓冲液（2×） |
100ml |
4℃或-20℃ |
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B |
Hoechst 33342 StainHoechst染色液 |
0.5ml |
-20℃避光 |
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C |
PI Stain PI染色液 |
0.5ml |
-20℃避光 |
保存与运输方法
保存：-20℃保存，1年有效。使用频繁可置4℃保存，5个月有效。Hoechst染色液和PI染色液需避光保存。
运输：冰袋运输。
注意事项
1） 荧光染料均存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。
2） Hoechst 33342孵育细胞时间不宜过长，一般控制在20min内。太长容易引起探针的发射光谱由蓝光向红光迁移，导致红色荧光与蓝色荧光的比例改变。
3） PI对人体有一定的刺激性，请注意适当防护。
4） 如果要进行组织的凋亡和坏死检测，请将组织消化制备成单细胞悬液后再检测。
5） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
保存与运输方法
保存：-20℃干燥保存，2年有效。
运输：室温运输。
注意事项
1）本品不是临床药物，只能用于科研用途，不能用于诊断或临床用途。
2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
一、细胞样本制备
1.1贴壁细胞
1.1.1 小心收集细胞培养液到一个无菌离心管内备用；
1.1.2 用胰蛋白酶消化细胞至细胞可以轻轻用移液枪或枪头吹打下来，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有贴壁细胞，并轻轻吹散细胞
1.1.3 收集上述细胞悬液到离心管内，4℃，1000g离心3~5min，使细胞沉至管底，小心吸取上清并丢弃，可留约50μl培养液，以免吸走细胞。【注意】：某些特殊细胞，如果沉淀不充分，可以适当提高离心力或者延长离心时间。
1.1.4 加入约1ml提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5ml无菌离心管，4℃，1000g离心3~5min，使细胞沉至管底。
1.1.5 小心吸取上清并丢弃，可留约50μl PBS，以免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
1.2 悬浮细胞
1.2.1 4℃，1000g离心3~5min，使细胞沉至管底，小心吸取上清并丢弃，可留约50μl培养液，以免吸走细胞。
1.2.2 加入约1ml提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5ml无菌离心管，4℃，1000g离心3~5min，使细胞沉至管底。
1.2.3 小心吸取上清并丢弃，可留约50μl PBS，以免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
二、染色前制备
2.1细胞染色缓冲液（1×）的准备：取适量细胞染色缓冲液（2×）与无菌去离子水或蒸馏水等比例混合，即为细胞染色缓冲液（1×），4℃保存备用。
2.2 细胞重悬：将上述收集好的0.1~1×06细胞，加入0.9ml细胞染色缓冲液（1×），重悬细胞沉淀。
三、Hoechst 33342/PI双染
3.1加入5μl Hoechst 33342染色液，置于37℃水浴，孵育5~15min。
3.2置于冰水冷却，4℃，1000g离心3~5min，使细胞沉至管底，弃上层染色液。
3.3加入0.9ml细胞染色缓冲液（1×），重悬细胞沉淀。
3.4加入5μl PI染色液，置于冰浴或4℃，孵育20~30min。
【注意】：也可一步法进行染色：加入5μl Hoechst 33342染色液和5μl PI染色液，轻轻混匀，置于冰浴或4℃，孵育20~30min。
四、结果分析
4.1流式细胞仪检测
用流式细胞仪在激发波长400~500nm处检测蓝色荧光，在＞630nm处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。
4.2荧光显微镜检测
检测前，4℃，1000g离心3～5min沉淀细胞，用PBS洗涤一次，再涂片观察红色和蓝色荧光。
【注意】：对于贴壁细胞，也可不收集细胞，弃培养液后直接依次按照上述比例加入细胞染色缓冲液（1×）、Hoechst 33342染色液、PI染色液，置于冰浴或4℃，孵育20～30min。染色后，PBS洗涤一次，再在荧光显微镜下观察。
4.3 结果呈现
正常细胞呈低蓝光/低红光，凋亡细胞呈高蓝光/低红光；坏死细胞呈低蓝光/高红光。
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