EHA101菌株；农杆菌感受态细胞；Rifampicin（Rif） 利福平；Kanamycin（kan）卡那霉素；EHA105；LBA4404；GV3101；AGL1；植物转基因研究；

GV3101菌株的背景为C58型，核基因含利福平抗性基因rif。为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pMP90（pTiC58DT-DNA），此质粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pMP90（pTiC58DT-DNA）质粒自身的T-DNA转移功能虽被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移）。pMP90（pTiC58DT-DNA）型Ti质粒携带筛选标签Gent，赋予GV3101菌株庆大霉素抗性。在GV3101菌株中转入help质粒：pSoup，即得到GV3101(pSoup)菌株，可协助pGreen，62SK，pGs2系列质粒在农杆菌内复制，同时赋予该菌株四环素（Tet）抗性。本菌株适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作。

我司（金畔生物）提供的GV3101(pSoup)化学转化感受态细胞经特殊工艺制作，基因型C58 (rifR) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) (gentR) Nopaline (pSoup-tetR)，经pGs2质粒（卡那霉素抗性）检测转化效率>103 cfu/μg DNA。

产品组分：

保存与运输条件：

保存：-80℃保存，一年有效。  

运输：干冰运输。

注意事项

1） 感受态细胞应保存在-80℃，不可反复冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。

2） 整个转化操作，严格根据相应温度及无菌条件要求进行。

3） 加入质粒的体积不应大于感受态体积的1/10。质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，会导致转化效率急剧下降。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

4） 为确保最高转化效率，整个操作过程应尽量轻柔，并保持低温。

5） 转化高浓度的质粒可相应减少最终涂板用量。

6） 平板上克隆密度过大时，由于营养不足，克隆生长变慢，菌落变小。为获得大菌落，应减少质粒用量。

7） 利福平浓度应≤25μg/ml，过高浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。

8） 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素，因Ti质粒丢失的概率极低（基本可以忽略）。

9） GV3101(pSoup)感受态细胞虽具有四环素抗性，但在转入目标质粒涂板筛选阳性克隆时，只需加入目标质粒抗性的抗生素，不用加四环素。

10） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1) 取-80℃保存的感受态细胞于室温或手心片刻待其部分融化，达到冰水混合状态时插入冰浴中使其完全融化。

2) 往100μl感受态细胞悬液中加入0.01~1μg（体积不大于10μl）目的DNA（注意：转化效率较高，第一次使用前建议做预实验确定适宜的质粒量），用手拨打管底使其混匀，依次于冰上静置5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min。

3) 加入700μl无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃振荡培养2~3h。

4) 6,000rpm离心1min，留取100μl左右上清，之后用枪轻轻吹打重悬菌体。之后加到含相应抗生素的LB或YEB平板上，用无菌玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。室温正置10 min，待液体被吸收后，倒置平板，28℃培养2-3天。

【注意】：当平板只含50μg/ml卡那霉素时，28℃培养48h即可；当平板中同时加入50μg/ml卡那霉素和20μg/ml利福平时，需28℃培养60h；若使用的平板含50μg/ml利福平，需在28℃培养72-90h。

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附表3常见农杆菌对抗生素敏感性总表