产品名称 |
规格 | ||
Caspase-6活性检测试剂盒(荧光法) | 20T |
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Caspase-6活性检测试剂盒(荧光法) | 100T |
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产品描述
Caspases(Cysteine-requiringAspartate Proteases)是一个高度保守的半胱氨酸蛋白酶家族,特异性识别底物中的天冬氨酸残基,在介导细胞凋亡的过程中发挥着非常重要的作用。Caspases以潜在酶原的形式表达,通过自发蛋白分解机制或经其他蛋白酶(通常是其他caspases)加工处理的方式被活化。人caspases可细分为三大功能组:细胞因子活化(caspase-1,-4,-5和-13),凋亡启动(caspase-2,-8,-9和-10)和凋亡执行(caspase-3,-6和-7)。
Caspase-6(Caspase 6),也称为Mch-2,执行caspases组中主要的成员之一,在凋亡过程中发挥作用。一旦凋亡诱导发生,起始caspases(比如caspase-9)被切割和激活。激活的上游caspases进一步处理下游的执行caspases(比如:caspase-3和caspase-6),通过将它们切割成大和小亚基,从而启动caspase级联反应,导致凋亡。Caspase-6主要的靶标是膜关联蛋白Lamin A,这个蛋白被切割会引起细胞膜功能错误、膜起泡和最终死亡。
Caspase-6活性检测试剂盒(荧光法)(Caspase-6 Activity Assay Kit, Fluorometric or Caspase-6 Fluorometric Assay Kit)以偶联上发色基团AFC的caspase-6序列特异性的多肽为底物。当底物被caspase-6剪切后,发色基团被释放出来,进而用荧光酶标仪来测定其荧光强度(激发波长=485nm,发射波长=535nm)。通过计算RFU凋亡诱导组/RFU阴性对照组的比值来确定凋亡诱导组caspase-6的活化程度。
本品适用于培养细胞以及新鲜组织的caspase-6活性检测。
产品包装
编号 | 组分名称 | 保存方法 | 货号(规格) | |
MX3232-20T | MX3232-100T | |||
MX3232-A | Lysis Buffer裂解缓冲液 | 2-8℃ | 5ml | 20ml |
MX3232-B | 2× Reaction Buffer 2×反应缓冲液 | 2-8℃ | 2ml | 10ml |
MX3232-C | Caspase-6 Substrate Caspase-6底物 | -20℃避光 | 6μl | 30μl |
MX3232-D | 0.1M DTT | -20℃避光 | 60μl | 250μl |
保存与运输方法
保存:-20℃保存,1年有效。开盒后置Lysis Buffer和2× Reaction Buffer于2-8℃保存。Caspase-6 Substrate和0.1M DTT需要避光冻存。
运输:冰袋运输。
注意事项
1) Caspase-6 Substrate需避光保存和使用。
2) 某些凋亡诱导剂诱导的凋亡可能通过caspase-6非依赖的方式进行,此种情况使用本品检测的caspase-6活性无明显变化,则,需要考虑凋亡机制中的其他信号通路。
3) 起始细胞数量需达3~5×106个或新鲜组织量达50~100mg,以保证达到测定所需的100~200μg蛋白量。Caspase-6的活性与细胞裂解后的蛋白含量有关,如测定的RFU值偏低,可通过适当延长反应时间来操作。但如果测定的RFU值依然不高,则要通过增加细胞数量或组织量的方法来提高蛋白量。
4) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
1.需要的其他试剂和材料
仪器:低温高速离心机、荧光酶标仪、微量移液器、玻璃匀浆器(组织样本)
耗材:1.5ml微量离心管、白色或黑色(不透明、平底)的96孔酶标板
试剂:PBS、蛋白定量试剂(比如:Bradford法蛋白浓度测定试剂盒)、ddH2O
2.试剂准备
2.1 Lysis Buffer(含DTT)
于实验前,按每50μl Lysis Buffer 加入0.5μl DTT的比例准备足量的裂解工作液,置于4℃或冰上待用。
2.2 2×Reaction Buffer(含DTT)
于使用前,按每50μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl DTT的比例准备足量的反应工作液。
2.3 Caspase-6 Substrate工作液
将Caspase-6 Substrate从冰箱内取出,置于室温(或25℃水浴)使其充分融化,低速离心使其沉至管底。于使用前,按照19.5μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl Caspase-6 Substrate的比例准备足量的Caspase-6 Substrate工作液。
3.样本准备
3.1 细胞裂解
a)用合适方法诱导细胞凋亡,同时设立阴性对照组(不加诱导剂),收集3~5×106个细胞。
b)PBS洗涤细胞2次(2000rpm,离心5min),尽量吸尽PBS上清。
c)往离心的沉淀细胞中加入100μl预冷的Lysis Buffer(含DTT),吹打混匀。
d)置冰上裂解20~60min,其间涡旋振荡3~4次,每次10s;或冻融2~3次。
e)4℃,10,000rpm离心1min。
f)小心吸取上清(含裂解释放的蛋白质)转移到新的EP管内,置于冰上待用。
g)取少量上清(1~2μl),用常规方法(Bradford法)测定蛋白浓度。
3.2 组织裂解
a)取50~100mg组织置于培养皿内,用手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块,加入150~200μl预冷的Lysis Buffer(含DTT),用玻璃匀浆器上下手动匀浆15次,注意低温操作。
b)将组织匀浆液转移到1.5ml预冷的离心管,10,000rpm,4℃离心5min。
c)小心吸取上清(含裂解释放的蛋白质)转移到新的EP管内,置于冰上待用。
d)取少量上清(1~2μl),用常规方法(Bradford法)测定蛋白浓度。
4.Caspase-6活性检测
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