MTT噻唑兰；台盼蓝染色法；CCK-8 细胞增殖和毒性检测试剂盒；WST-8；CAS：298-93-1；

基本描述：

噻唑兰（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,简称MTT，CAS：298-93-1），也称作溴化噻唑蓝四氮唑，是一种黄色染料，已经广泛替代传统的台盼蓝染色法或者放射性同位素插入法，用来检测细胞活力、细胞增殖以及毒性分析。MTT是一种可接受氢离子的化合物染料，带正电荷，具有细胞膜渗透性。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源进入的MTT还原成为水不溶性的蓝紫色MTT-甲臜结晶，而死细胞不具此功能。甲臜结晶不能穿透细胞膜，因此沉积在处于增殖且未受损伤的细胞内。在特定溶剂的作用下完全溶解甲臜结晶，然后通过酶标仪测定570 nm附近的吸光度。细胞增殖越多，则吸光度越高；细胞毒性越大，则吸光度越低。

本MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit）采用独特的甲臜溶解液，能够非常好的完全甲臜结晶，使检测本底低、灵敏度高，且线性范围宽。

产品组分

保存与运输方法

保存：-20℃避光保存，1年有效。MTT溶液（5mg/ml）第一次使用亦可根据需要分装后-20℃避光保存；甲臜溶解液亦可室温保存。

运输：冰袋运输。

注意事项

1. 使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发的问题。①由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加PBS、无菌水或培养液；②可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方以缓解蒸发。
2. MTT溶液在低温下会凝固，请置于室温或20-25℃水浴温育片刻至全部融解后再使用。
3. MTT溶液需尽量减少反复冻融的次数，若单次用量很少，建议根据需求分装后置于-20℃保存。MTT溶液颜色如变为灰绿色，请勿使用。
4. 甲臜溶解液当置于-20℃保存需解冻使用，或室温保存产生沉淀，可置于37℃水浴孵育以促进溶解，并且必须全部溶解后混匀使用。
5. 加入甲臜溶解液后请轻轻混匀，但需注意避免产生泡沫。亦可借助显微镜观察甲臜是否完全溶解。
6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法（以96孔板为例）

1. 收集对数生长期的细胞，用含血清的培养液配制成单细胞悬液，调整细胞密度，以每孔3000-10,000个细胞接种到96孔板，每孔体积100µl，培养板的边缘孔用无菌PBS填充。设置空白孔和对照孔。【注①】：通常情况，细胞增殖实验每孔加3000个细胞，细胞毒性实验每孔加6000个细胞。具体每孔所用细胞数目，需根据细胞大小、增殖速度的快慢等来决定。【注②】：需设置空白孔（不含细胞，含培养液、MTT和甲臜溶解液），对照孔（含细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT和甲臜溶解液），每组设置3个复孔。
2. 37℃，5% CO2继续培养或根据实验具体需求进行培养，一般培养6-24h。
3. 根据实验具体需求，给予0-20µl干预药物处理，37℃，5% CO2继续培养至合适时间。
4. 小心吸掉培养液，每孔加入100µl新鲜培养液，再加入10µl MTT溶液（5 mg/ml），加样时尽量勤换枪头，控制加量误差。继续培养4h。
5. 小心吸掉培养液，每孔加入110µl甲臜溶解液，置摇床上低速振荡10min，使得结晶物充分溶解。可在光学显微镜下观察结晶物是否完全溶解。如果紫色结晶较小或较少，溶解的时间会短些；如果紫色结晶较大或较多，溶解的时间会长些。
6. 在酶标仪上摇匀后，选择570nm，测定吸光度。记录结果，比色以空白调零。【注①】：对于细胞毒性检测，以未经药物处理细胞的OD值为100%，然后计算药物处理细胞所占的比率（x），公式如下：OD（未经药物处理细胞）/OD（药物处理细胞）=100%/x。然后建立直方图。

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