描述

Alkaline Phosphatase Assay Kit (Colorimetric) 碱性磷酸酶检测试剂盒（显色法）

产品标签：

Phosphatase, Alkaline碱性磷酸酶；ALP/AKP；对硝基苯酚磷酸盐（pNPP）；偶氮偶联法；显色法（定量）；染色法（定性）；

产品信息

产品名称	产品编号	规格	价格（元）
Alkaline Phosphatase Assay Kit (Colorimetric)    碱性磷酸酶检测试剂盒（显色法）	MP7501-100T	100T	562

【温馨提示I】：见碱性磷酸酶产品专题，了解更多相关产品资料；

【温馨提示II】：见碱性磷酸酶染色试剂盒产品；

【温馨提示III】：见碱性磷酸酶活性检测试剂盒产品专题；

【温馨提示IV】：见碱性磷酸酶常用生化底物及试剂盒产品；

产品描述

碱性磷酸酶（Phosphatase, Alkaline，ALP/AP/AKP/ALKP/ALPase，EC 3.1.3.1），碱性条件下能催化磷酸单酯水解，常见底物有对硝基苯酚磷酸盐（pNPP）、磷酸苯酯、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-1-磷酸、果糖-6-磷酸、腺苷-5-磷酸等。常见ALP包括肠道碱性磷酸酶（如小牛肠来源，calf intestinal）、胎盘碱性磷酸酶（placental alkaline phosphatase）、非组织特异性碱性磷酸酶（tissue-nonspecific isozyme, alkaline phosphatase）等。

碱性磷酸酶（ALP）活性的变化与一系列生理和病理事件紧密关联，比如骨骼发育、骨骼相关疾病、妊娠相关疾病和炎症性肠病（inflammatory bowel diseases）等。正因如此，ALP被用作衡量生理特征或疾病的参照指标。另外，ALP活性检测在环境监测、食品质量控制等方面也呈现重要作用。如，干细胞如诱导多潜能干细胞iPS，ALP活性很高，则ALP常被用作iPS诱导成功的标志；分化的结肠癌细胞内ALP活性显著提高，则ALP常被当做结肠癌细胞分化程度的指标（定性/定量）；血清中ALP水平提高，被称作高碱性磷酸酶血症，此症状被认为和恶性胆管阻塞、原发性胆管硬化、原发性硬化胆管炎、肝淋巴瘤和肝肉瘤等肝胆疾病密切相关；ALP是成骨细胞的副产物，血清中ALP活性升高和骨头发育密切关联；

本试剂盒能对细胞或组织裂解液或匀浆液、血清、血浆、尿液等样品内源性碱性磷酸酶活性进行检测。原理在于：对硝基苯酚磷酸盐（pNPP）是一种常用的碱性磷酸酶（ALP）显色底物，碱性条件下能被ALP催化生成对硝基酚（para-nitrophenol，p-nitrophenol），呈黄色产物，可在400-415nm检测到吸光度。产物黄色越深，代表ALP活性越高，反之则酶活性越低。则通过比色分析可定量检测ALP水平。

本试剂盒可检测100个样品，包括标准品和空白对照。

产品组成

组分编号	组分名称	规格	保存方式
MP7501-A	pNPP显色底物	2管	-20℃避光保存
MP7501-B	检测缓冲液	15 mL	-20℃保存
MP7501-C	反应终止液	12 mL	-20℃保存
MP7501-D	对硝基苯酚标准品（10mM）	100μl	-20℃避光保存

保存与运输方法

保存：-20℃冻存，1年稳定。

运输：冰袋运输。

注意事项

1. 若希望进行酶活力的绝对定量，进行酶反应时必须注意精确计时。此时推荐孵育30min等较长时间，以减小操作过程中的时间误差。若样品中酶活性较高，则可预先适当稀释样品。

2. 样品溶液中须避免出现EDTA、氟离子、柠檬酸盐等碱性磷酸酶抑制剂。

3. 检测缓冲液和对硝基苯酚标准品对人体有害，请注意适当防护。反应终止液有腐蚀性，请小心操作。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作步骤

1. 试剂准备：将所有试剂取出，恢复至室温待用。

a) 显色底物溶液：取一管显色底物，溶解于2.5ml的检测缓冲液中，充分溶解和混匀，冰上放置。新鲜配制的显色底物溶液需在数小时（≤ 6h）内使用。

b) 标准品工作液：取10μl 对硝基苯酚标准品（10mM），用检测缓冲液稀释至200μl ，使得终浓度为0.5mM。

2. 样品准备

a) 细胞或组织裂解液的准备：采用适当细胞或组织裂解液裂解细胞和组织，如有必要需进行适当匀浆，随后离心取上清，用于ALP活性检测。【注意】：裂解液中不能含磷酸酶抑制剂。样品可-80℃冻存，避免反复冻融。

b) 血浆、血清和尿液的准备：血浆和血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，但为了消除样品本身颜色的干扰，需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。【注意】：血浆制备不能用含EDTA和柠檬酸盐的抗凝管。尿液通常也可直接用于测定。上述样品可-80℃冻存，避免反复冻融。

c) 样品的稀释：若样品中含有较高的ALP活性，可以使用原有的裂解液或PBS等进行稀释，也可以用试剂盒中的检测缓冲液进行稀释。若使用试剂盒内的检测缓冲液进行稀释，需注意保留足够的缓冲液用于该试剂盒的检测过程。

3．加样

参考下表使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔。标准品的用量分别为4、8、16、24、32和 40μl，样品通常可以直接加50μl。如果样品中的ALP活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。

4. 混匀：用枪头轻轻吹打混匀，也可借助摇床进行混匀。
5. 孵育：37℃孵育5-10min。（若待测样品中ALP活性较低时，可适当延长孵育时间至30min）

6. 终止：每孔加入100μl反应终止液终止反应。此时，标准品或有ALP活性的孔会呈现不同深浅的黄色。

7. 检测：405nm处测定吸光度。如果不能测定405nm，也可以在400-415nm范围内检测吸光度。如果不能立即测定，可以在数小时内完成测定，所显现的黄色在数小时内稳定。

8. 单位定义：

碱性磷酸酶活性单位的定义：在pH9.8的二乙醇胺（DEA）缓冲液中，37℃条件下，每min水解pNPP显色底物产生1μM对硝基苯酚（p-nitrophenol）所需的ALP量定义为一个酶活力单位，也被称作一个DEA酶活力单位。在pH9.6的甘氨酸缓冲液中，25℃条件下，每min水解pNPP显色底物产生1μM对硝基苯酚（p-nitrophenol）所需的ALP量定义为一个酶活力单位，也被称作一个甘氨酸酶活力单位。一个甘氨酸酶活力单位约相当于3个DEA酶活力单位。本试剂盒测定的是DEA酶活力单位。

9. 结果分析：根据酶活性单位的定义，计算出样品中的碱性磷酸酶活性。 

常见问题

1.   说明书提及配制好的显色底物溶液需在6小时内使用完。试剂盒只提供了两管显色底物，是不是意味

着只能做两次？

回答：是的。显色底物以粉末形式提供，单次实验需取一管全部配成显色底物溶液，且需要在6小时内用完，不建议冻存后再使用。为了避免试剂盒浪费，请在累积足够的样本后再进行检测。

2.   本试剂盒适用于细胞培养上清内碱性磷酸酶的检测吗？

回答：不可以。本试剂盒常用于细胞裂解液的检测，不适合细胞培养上清的检测，因为上清内的酶量偏低，不足以被本试剂盒检测到，无法反映真实结果。

3.   本试剂盒内提及合适的细胞和组织裂解液，有没有推荐的？

回答：推荐使用我司的免疫印迹及免疫沉淀用裂解液（不含蛋白酶/磷酸酶抑制剂）（Cat#: MP1508-100ML）。或自行配制含0.2% Triton X-100的PBS，TBS或生理盐水等适当溶液。裂解液内不能含任何磷酸酶抑制剂。

4.   本试剂盒内的碱性磷酸酶活性如何计算所得？

回答：根据标准曲线和待测样品的吸光值，可计算到样品中对硝基苯酚（p-Nitrophenol）生成量。再根据酶活性定义：将生成的对硝基苯酚摩尔量除以孵育时间，进行酶活计算。制作标准曲线时，可以将横坐标体积转换算成摩尔数，再绘制标准曲线，方便后续计算。根据标准曲线方程计算出生成的对硝基苯酚摩尔量除以37℃孵育的时间即得到酶活。

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货号	名称	规格
MP1508-100ML	免疫印迹及免疫沉淀用裂解液（不含蛋白酶/磷酸酶抑制剂）	100ml
MP7501-100T	碱性磷酸酶检测试剂盒（显色法）	100T
MP7504-100ML	碱性磷酸酶染色液（改良钙钴法）	2×50ml
MP7505-30ML	碱性磷酸酶染色液（偶氮偶联法）	3×10ml