描述

CPFect siRNA/miRNA Transfection Kit

CPFect小分子RNA转染试剂盒

产品信息

产品名称	产品编号	规格	价格（元）
CPFect siRNA/miRNA Transfection Kit       CPFect小分子RNA转染试剂盒	MX2216-0.5KIT	0.5kit	1580
	MX2216-1KIT	1kit	2950

产品描述

CPFect小分子RNA转染试剂盒（CPFect siRNA/miRNA Transfection Kit）是一款专门开发用于小分子RNA（比如siRNA、miRNA）的转染试剂盒，含有转染所需的转染试剂，以及转染缓冲液。本品具极好的生物相容性、转染效率高、细胞毒性小。转染时无需进行培养基更换操作，特别适合各种高通量细胞筛选实验、方便、快速、高效。

试剂盒组分

组分编号	组分名称	货号（规格）
		MX2216-0.5KIT	MX2216-1KIT
MX2216-A	CPFect siRNA/miRNA Transfection Reagent	0.5ml	2×0.5ml
MX2216-B	10× CPFect Transfection Buffer	0.5ml	2×0.5ml

保存与运输方法

保存：+4℃保存，1年有效。

运输：室温运输。

注意事项

1）使用高纯的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率，内毒素是影响转染效率高低的重要因素。

2）转染过程中不要添加抗生素到培养基，否则会导致细胞死亡。

3）CPFect siRNA/miRNA Transfection Reagent（MX2216-A）应该在4℃保存，不可冻存。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

使用方法

一、准备工作

1.1 从冰箱内取出 CPFect siRNA/miRNA Transfection Reagent（MX2216-A）后，在漩涡振荡器中充分振荡后，室温放置，使之恢复到室温后使用。

1.2 从冰箱内取出10× CPFect Transfection Buffer（MX2216-B）后，取适量按照1：9的比例用PBS稀释到1×，混匀后待用。

二、转染方法（以24孔板内转染siRNA为例）

2.1 接种细胞

a. 贴壁细胞（以HeLa细胞为例）：转染前一天，接种1×10⁵~5×10⁵个细胞至含有适量完全培养基的24孔板培养孔中，使转染时的细胞密度能够达到30~50%。

b. 悬浮细胞（以THP-1细胞为例）：接种1×10⁵~5×10⁵个细胞至含有适量完全培养基的24孔板培养孔中。

【注意】：

1）不同细胞生长速度不同，接种细胞的数量，细胞密度需要依据细胞类型、培养时间、实验目的而定；

2）每孔接种的细胞数量尽量相同，使细胞均匀分布。

3）由于自身特性问题，悬浮细胞相对较难转染，需要优化条件以提高转染效率，如遇细胞特殊，可更换为电转方式。

 

2.2 转染步骤

对于每个转染样品，请按以下步骤准备：

a. 稀释 siRNA：用 30μl 1×CPFect Transfection Buffer（v2）稀释 1.25μl 20μM siRNA 储存液（v3），轻轻混匀，室温孵育 5min。

b. 混合液制备：加入 3μl CPFect siRNA/miRNA Transfection Reagent（v4），轻轻吹打混匀，室温孵育 0～15min，制备成转染复合物。

【注意】：

1）请不要振荡，溶液可能会有浑浊，但不会影响转染；

2）混合液可室温放置一段时间，但不宜超过 24h。

c. 将 CPFect转染复合物加入到适量无双抗完全培养基（v1）中，轻轻混匀。

【注意】：CPFect转染复合物加入原细胞培养基中一般无需移除或更换。但也可依具体实验情况进行优化。 d. （可选）进行其他必要的特殊处理（如加药处理） ；

e. 将培养板置于 37℃、CO₂培养箱中培养24~96h（培养时间与实验目的相关）。

 

2.3 效果检测

转染完成后 24~72小时均可进行siRNA沉默效果检测，最佳检测时间与细胞类型，转染试剂，检测目的等相关。

1）RNA水平的检测（RNAi沉默鉴定标准）：siRNA作用的目标分子是目的基因的RNA，在RISC系统的作用下剪切目标RNA，故检测目的基因的RNA水平可直接反应siRNA是否发挥相应作用，且通过qRT-PCR可计算具体的抑制效率。一般siRNA转染后 24~72h即可检测到目的基因RNA表达明显降低。

【注意】：引物设计质量很重要，需要确保检测引物有效性。

2）蛋白水平的检测：对于蛋白编码基因，还需检测相应的蛋白表达水平，以确定是否目的蛋白也成功下调。由于蛋白表达水平的变化受多个因素影响，有时候会出现RNA水平成功抑制了而蛋白水平变化不明显的情况。若蛋白表达水平下降不明显，需认真检测其mRNA的表达水平，用来判断RNAi不理想的原因。

3）功能筛选：应用 BrdU或EdU细胞增殖，细胞凋亡等方法进行siRNA对细胞功能的直接筛选。

 

转染体系的调整参考用表

表I. 不同细胞培养容器转染时培养基、核酸及转染试剂用量

	siRNA终浓度	单孔体积	培养基（v1）	Buffer（v2）	siRNA（v3）	Reagent (v 4)
96-well	100nM	100μl	92.90μl	6μl	0.5μl	0.6μl
	50nM	100μl	93.15μl	6μl	0.25μl	0.6μl
	30nM	100μl	93.25μl	6μl	0.15μl	0.6μl
	20nM	100μl	93.30μl	6μl	0.1μl	0.6μl
	10nM	100μl	93.35μl	6μl	0.05μl	0.6μl
24-well	100nM	500μl	464.50μl	30μl	2.5μl	3μl
	50nM *	500μl	465.75μl	30μl	1.25μl	3μl
	30nM	500μl	466.25μl	30μl	0.75μl	3μl
	20nM	500μl	466.50μl	30μl	0.5μl	3μl
	10nM	500μl	466.75μl	30μl	0.25μl	3μl
12-well	100nM	1ml	929.00μl	60μl	5μl	6μl
	50nM	1ml	931.50μl	60μl	2.5μl	6μl
	30nM	1ml	932.50μl	60μl	1.5μl	6μl
	20nM	1ml	933.00μl	60μl	1μl	6μl
	10nM	1ml	933.50μl	60μl	0.5μl	6μl
6-well	100nM	2ml	1858.00μl	120μl	10μl	12μl
	50nM	2ml	1863.00μl	120μl	5μl	12μl
	30nM	2ml	1865.00μl	120μl	3μl	12μl
	20nM	2ml	1866.00μl	120μl	2μl	12μl
	10nM	2ml	1867.00μl	120μl	1μl	12μl
【*】：实际参考用量示例，对于部分细胞类型需进一步优化。