Plant Protoplast Transformation Kit II (PEG-Mediated)  植物原生质体转化试剂盒II（PEG法）

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Plant Protoplast 植物原生质体；PEG-mediated protoplast transformation 聚乙二醇介导的原生质体转化；Yakult Honsha；Cellulase R-10 纤维素酶R-10；Macerozyme R-10 离析酶R-10；二乙酸荧光素(FDA) 原生质体活力检测；

产品信息                                                                                                            

产品名称

 产品编号
Plant Protoplast Transformation Kit II (PEG-Mediated)    MX7382-20T 20T

原生质体（Protoplast）是指植物细胞去掉细胞壁后的裸露部分，体外培养条件下，具有以下功能：1）具全能型，可再生细胞壁，进行连续的细胞分裂且能再生成完整植株的能力；2）具摄取外源大分子、细胞器，以及细菌、病毒的能力，从而原生质体是进行遗传操作，基因转移的良好材料；3）通过同种和异种植物的原生质体融合，可产生异核体，实现体细胞杂交，从而培育出具有抗病原或更高产量的新品种。

原生质体（Protoplast）的制备最主流的技术是酶解法，因其具有消化温柔，操作简单，且良好维持原生质体完整性的特点。工作原理是根据植物细胞壁的结构特征选择合适的酶进行处理，植物细胞壁主要由多糖（纤维素、半纤维素、果胶等）以及少量的蛋白和脂质构成。因此，通过使用纤维素酶、离析酶、半纤维素酶、果胶酶等复合酶来降解细胞壁，即可得到原生质体。

原生质体（Protoplast）的转化方法很多，主要有PEG介导转化法、电击穿孔转化法、脂质体介导转化法、农杆菌共培养转化法等。

本试剂盒是PEG介导的原生质体转化法，操作简单和便捷。试剂盒含有植物原生质体制备（包含消化酶和细胞筛网）和植物转化需要的所有试剂，按照单次10ml酶液体系来算，可做20次。

试剂盒组分

组分编号            组分名称 规格（20T）      储存方法            
MX7382-A Solution A-Enzyme solution buffer (2×)溶液A       100ml -20℃保存
MX7382-B Solution B-W5 solution溶液B 200ml -20℃保存
MX7382-C Solution C-MMG solution溶液C 25ml -20℃保存
MX7382-D Solution D-Transformation solution溶液D 5ml -20℃保存
MX7382-E Solution E-WI solution溶液E 25ml -20℃保存
MX7382-F Solution F-Reduced reagent溶液F 1ml RT保存
MX7382-G Solution G-BSA solution (50mg/ml)溶液G 5ml -20℃保存
MX7382-H Macerozyme R-10离析酶R-10 1g -20℃保存
MX7382-I Cellulase R-10纤维素酶R-10 3g -20℃保存
MX7382-J 70µm Cell strainer细胞筛网 1包（5个） RT保存

保存与运输方法

保存：按照说明书要求对各组分进行归位保存，1年有效。

运输：室温运输。

注意事项

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

  1. 需要准备材料
    1. 平头镊子
    2. 一次性刀片
    3. 1.5ml离心管
    4. 50ml离心管
    5. 恒温加热水浴锅

 

  1. 原生质体分离

2.1按照以下表格体系，配制即用型酶溶液：【注意：此溶液现配现用】

组分 10ml配制量             50ml配制量           
溶液A (2×酶溶解液)           5ml 50ml
离析酶R-10 40mg 200mg
纤维素酶R-10 150mg 750mg
溶液F（还原剂） 5 μl 25μl
溶液G（50mg/ml BSA） 0.2ml 1ml
无菌水 定容到10ml 定容到50ml

2.2 取生长状态良好的叶片切成0.5-1mm的小条，按照20个叶片加10ml即用型酶溶液的比例迅速将切好的叶片小条浸泡于即用型酶溶液内，室温避光酶解3h。

【注意】：酶解时间与叶片类型、叶片生长状态有关，请根据实际实验进行调整。酶溶液变为绿色表明原生质体已经分离，显微镜镜检确定是否分离。

2.3 酶解后加入10ml溶液B，轻柔混匀。

2.4 用70μm细胞筛网过滤步骤2.3获得的溶液，去除未消化的叶片和杂质，收集滤液到50ml离心管内。

2.5 滤液于100×g，室温离心2min，吸掉上清。

2.6 加1ml溶液B重悬原生质体，冰浴30min，使得原生质体自然沉淀到底部。

2.7 小心吸掉上清，不要触动原生质体沉淀。将沉淀重悬于1ml溶液C，即得到原生质体溶液。

  2. 原生质体转化

3.1取10μl质粒DNA（浓度为1-2μg/μl）于1.5ml离心管。

3.2加入100μl原生质体溶液，轻柔混匀。

3.3加入等体积（110μl）溶液D，轻柔完全混匀，室温孵育15min，间歇轻柔混匀。

3.4加入2倍体积（440μl）溶液B，轻柔完全混匀，终止转化过程。

3.5于100×g，室温离心2min，吸掉上清。

3.6将沉淀重悬于1ml溶液E中。

  2. 原生质体培养和收集

4.1原生质体溶液室温孵育2-16h。

【注意】：根据特定实验确定孵育时间。RNA分析一般孵育2-6h；酶活性分析和蛋白标记一般孵育2-16h。

4.2于100×g，室温离心2min收集原生质体，去掉大部分上清。

4.3原生质体沉淀重悬于剩余溶液中，-80℃保存。