EHA105菌株；农杆菌感受态细胞；Rifampicin（Rif） 利福平；Kanamycin（kan）卡那霉素； EHA101；LBA4404；GV3101；AGL1；植物转基因研究；
| 货号 | 产品名称 | 规格 | |
| MF2307-0500UL | EHA105 Electrocompetent cell 农杆菌电转感受态细胞 | 10×50μl | |
| MF2307-2500UL | EHA105 Electrocompetent cell 农杆菌电转感受态细胞 | 50×50μl |
EHA105菌株由EHA101菌株改造而来，染色体背景为C58，核基因含利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pEHA105（pTiBo542DT-DNA），此质粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pEHA105（pTiBo542DT-DNA）质粒自身的T-DNA转移功能虽被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移）。EHA105菌株适用于水稻、烟草等植物的转基因操作。
我司（金畔生物）提供的EHA105电转感受态细胞经特殊工艺制作，特别适合大质粒的转化。基因型为C58 (rifR) Ti pEHA105 (pTiBo542DT- DNA) Succinamopine，经pCAMBIA2301质粒检测转化效率>105cfu/μg DNA。
产品组分：
| 组分编号 | 组分名称 |
货号（规格） |
|
| MF2307-0500UL | MF2307-2500UL | ||
| MF2307-A | EHA105 Electrocompetent cell | 10×50μl | 50×50μl |
| MF2307-B | pCAMBIA2301 Control Vector (10ng/μl) | 10μl | 10μl |
保存与运输条件：
保存：-80℃保存，1年有效。
运输：干冰运输。
注意事项
1） 感受态细胞应保存在-80℃，不可反复冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。
2） 整个转化操作，严格根据相应温度及无菌条件要求进行。
3） 加入质粒的体积不应大于感受态体积的1/10。质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，会导致转化效率急剧下降。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
4） 为确保最高转化效率，整个操作过程应尽量轻柔，并保持低温。
5） 转化高浓度的质粒可相应减少最终涂板用量。
6） 平板上克隆密度过大时，由于营养不足，克隆生长变慢，菌落变小。为获得大菌落，应减少质粒用量。
7） 利福平浓度应≤25μg/ml，过高浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。我司EHA101感受态计算转化效率时所用平板只含50μg/ml卡那霉素，若所用平板含20μg/ml 利福平，则转化效率降低到1/2。
8） 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入Ti质粒筛选抗生素可防止Ti质粒丢失，但这些筛选抗生素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑这些筛选抗生素，因Ti质粒丢失的概率极低（基本可以忽略）。
9） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
1) 将0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净吸水纸上5min，待其沥干水分，正置5min，使乙醇充分挥发干净，立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖，冰中静置5min使其充分降温。
2) 取-80℃保存的感受态细胞于室温或手心片刻待其部分融化，达到冰水混合状态时插入冰浴中使其完全融化。
3) 往50μl感受态细胞悬液中加入0.01~1μg（体积不大于6μl）质粒DNA，用手拨打管底使其混匀，立即插入冰中。用枪轻轻吹打混匀感受态细胞-质粒之后快速转移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用【注意：由于感受态转化效率较高，第一次使用最好做预试验确定最佳的质粒用量】。
4) 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此参数参考Bio-rad，具体使用请参考电转仪推荐步骤来操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。
5) 加入700 μl无抗生素的LB并转移到感受态空管中，于28℃振荡培养2~3h。
6) 6,000rpm离心1min，吸掉600ul上清，之后用枪轻轻吹打重悬菌体。之后加到含相应抗生素的LB或YEB平板上，用无菌玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。室温正置10 min，待液体被吸收后，倒置平板，28℃培养2-3天。【注意：当平板只含转化所用双元载体抗生素时，28℃培养48h即可；当平板中加入双元载体抗生素的同时，再加入20μg/ml 利福平时，需28℃培养60h；若使用的平板含50μg/ml 利福平，需在28℃培养72-90h。】
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| MS0017-5G | Carbenicillin, Disodium Salt 羧苄青霉素二钠盐 | 5g |
| MS0017-25G | Carbenicillin, Disodium Salt 羧苄青霉素二钠盐 | 25g |
| MS0019-10G | Kanamycin Sulfate 硫酸卡那霉素 | 10g |
| MS0019-25G | Kanamycin Sulfate 硫酸卡那霉素 | 25g |
| MS0025-1G | Gentamycin Sulfate Salt 硫酸庆大霉素 | 1g |
| MS0023-25G | Streptomycin Sulfate, USP Grade 硫酸链霉素 | 25g |
附表1 固体和液体LB培养基配方
| 组分Component | LB（液体）/升 | LB（固体）/升 |
| 胰蛋白胨Tryptone | 10g | 10g |
| 酵母提取物Yeast extract | 5g | 5g |
| 氯化钠NaCl | 10g | 10g |
| 1N NaOH | 调整pH至7.0 | 调整pH至7.0 |
| 琼脂Agar | / | 15g |
附表2 固体和液体YEB培养基配方
| 组分Component | YEB（液体）/升 | YEB（固体）/升 |
| 胰蛋白胨Tryptone | 5g | 5g |
| 酵母提取物Yeast extract | 1g | 1g |
| 牛肉浸膏Beef Extract | 5g | 5g |
| 蔗糖Sucrose | 5g | 5g |
| 七水硫酸镁MgSO4·7H2O | 0.49g | 0.49g |
| 1N NaOH | 调整pH至7.0 | 调整pH至7.0 |
| 琼脂Agar | / | 15g |
附表3 常见农杆菌对抗生素敏感性总表
| 农杆菌菌株 | 羧苄（carb） | 链霉素（strep） | 利福平（rif） | 庆大霉素（gent） | 卡那霉素（kan） |
| EHA101 | S | S | R | S | R |
| EHA105 | S | S | R | S | S |
| LBA4404 | S | R | R | S | S |
| GV3101 | S | S | R | R | S |
| AGL1 | R | S | R | S | S |
| 【备注】：S代表敏感，R代表抗性。 | |||||