CCK-8细胞增殖及毒性检测;WST-8；MTT 噻唑兰；Alamar Blue 阿尔玛蓝；XTT；WST-1；
| 产品名称 | 产品编号 | 规格 | ||
| Cell Counting Kit (CCK-8) 细胞增殖及毒性检测试剂 | MX3008-1ML | 1ml (100T) | ||
| Cell Counting Kit (CCK-8) 细胞增殖及毒性检测试剂 | MX3008-5ML | 5ml (500T) | ||
| Cell Counting Kit (CCK-8) 细胞增殖及毒性检测试剂 | MX3008-10ML | 10ml (1000T) | ||
| Cell Counting Kit (CCK-8) 细胞增殖及毒性检测试剂 | MX3008-50ML | 50ml (5×1000T) | ||
| Cell Counting Kit (CCK-8) 细胞增殖及毒性检测试剂 | MX3008-100ML | 100ml (10×1000T) |
产品描述
Cell Counting Kit (CCK-8)，中文名CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂，简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8（化学名为2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的一种广泛应用于细胞增殖和毒性检测的快速高灵敏度试剂盒。
WST-8是MTT（噻唑兰）的升级产品，检测原理（见下图）为：在电子耦合试剂存在的情况下，WST-8可被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。颜色的深浅与活细胞数量（细胞增殖）成正比，与细胞毒性成反比。通过酶标仪在450nm波长处测定OD值来反映细胞增殖，以及细胞毒性水平。
CCK-8法应用非常广泛，包括药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。
保存与运输方法
保存：2-8℃避光保存，一年有效。-20℃避光保存，二年有效。
运输：冰袋运输。
注意事项
1） 第一次做实验时，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。
2） 接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种几个孔就混匀一下。培养板周围一圈孔培养基容易挥发，为减少误差，建议培养板的四边每孔只加培养基，而不作为指标检测孔。
3） 培养时间根据细胞种类不同和每孔内细胞数量的多少而异。一般情况白细胞较难显色，因此需要较长的CCK-8反应时间或增大细胞数量（~105个细胞/孔）。悬浮细胞比贴壁细胞较难显色，对于悬浮细胞，加入CCK-8培养1-4小时后，可先从培养箱中取出，目测染色程度或用酶标仪测定来决定。若显色困难，可将培养板放回培养箱，继续培养数小时后再确定。对于贴壁细胞，CCK-8的培养时间一般为1-4小时，但培养30分钟左右可取出肉眼观察显色程度（根据细胞类型而定，需要摸索一定条件）。注意：CCK-8的最佳反应时间以实际显色的最佳时间为准。
4） 有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入CCK-8试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，会干扰OD值读数。
5） 加CCK-8速度要快，减少试剂在移液器上的残留。为使CCK-8试剂和培养基充分混匀，建议在加入CCK-8后轻轻震摇培养板。为了避免加样时由于CCK-8在枪头上残留所引入的误差，可以在加样前用培养基稀释CCK-8并混匀后加样。
6） CCK-8的核心成分WST-8会与还原剂反应生成WST-8甲臢，若实验体系内含有还原剂，请务必检测背景OD值（即在不含细胞的培养基中加入药物，然后加入CCK-8在一定时间内检测）和不加药物的培养基（只加CCK-8）进行比较。如果OD值明显偏高，则说明的确存在反应。
7） 若细胞培养时间较长，培养基颜色发生变化或pH发生变化，建议更换新鲜的培养基后再加入CCK-8。含酚红的培养基不影响CCK-8测定细胞活性。
8） 如果样品为高浑浊的细胞悬液，建议设定600nm（或600nm以上）作为参比波长，扣除参比波长的OD值即可。
9） CCK-8对细胞毒性非常低，其与活细胞脱氢酶持续反应使溶液颜色不断加深，OD值不断增加（由于脱氢酶是持续产生的）。另外，其他实验比如中兴红法或结晶紫法，也可在CCK-8检测完成后继续进行。
10）若需要测定细胞的具体数量，建议先做一个标准曲线。
11）如果没有450nm的滤光片，可以使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片，但是450nm滤光片的检测灵敏度最高。
12）关于CCK-8的更多问题，请见附录I. CCK-8使用常见问题集锦。
13）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
1. 制作标准曲线（测定细胞具体数量）
1） 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞到培养板内。
2） 按比例（例如：1/2比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每个浓度建议3-6个复孔。
3） 接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间。）
2. 细胞活性检测
1） 在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养一段时间（37℃，5% CO2）。
2） 向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。
3） 将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
4） 用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
5） 若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
3. 细胞增殖-毒性检测
1） 在96孔板中配制100μL的细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养24小时（37℃，5% CO2）。
2） 向培养板加入10μL不同浓度的待测物质。
3） 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。
4） 向每孔加入10μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。
5） 将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
6） 用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
7） 若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
【注意】：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
活力计算
细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100
A（加药）：实验孔（含有细胞的培养基、CCK-8溶液和药物）的吸光度
A（空白）：空白孔（不含细胞和药物的培养基，含CCK-8溶液）的吸光度
A（0加药）：对照孔（含有细胞的培养基、CCK-8溶液，不含药物）的吸光度
*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性
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附录I. CCK-8使用常见问题集锦
1） CCK-8与其他细胞增殖-毒性检测方法的优势在哪里？
| 检测方法
特征比较 |
MTT法 | XTT法 | WST-1法 | CCK-8法 |
| 甲臢产物的水溶性 | 差，需有机溶剂溶解后再检测 | 好 | 好 | 好 |
| 产品性状 | 粉末 | 2瓶溶液 | 单瓶溶液（或粉末+溶液） | 单瓶溶液 |
| 使用方法 | 配成溶液后使用 | 现配现用 | 即开即用（或现配现用） | 即开即用 |
| 检测灵敏度 | 高 | 很高 | 很高 | 非常高 |
| 检测时间 | 较长 | 较短 | 较短 | 最短 |
| 检测波长 | 560-600nm | 420-480nm | 420-480nm | 430-490nm |
| 细胞毒性 | 高，细胞形态完全消失 | 很低，细胞形态不变 | 很低，细胞形态不变 | 很低，细胞形态不变 |
| 试剂稳定性 | 一般 | 较差 | 一般 | 很好 |
| 批量样品检测 | 可以 | 非常适合 | 非常适合 | 非常适合 |
| 便捷程度 | 一般 | 便捷 | 便捷 | 非常便捷 |
2） 单孔接种多少个细胞？
当使用96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1000个/孔（100μL培养基）。检测白细胞的灵敏度相对较低，因此建议接种量不低于2500个/孔（100μL培养基），建议先做几个孔摸索接种细胞的数量。若使用24孔板或6孔板，请先计算每孔相应的接种量，然后按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8。
3） 如何设定空白对照？
在不含细胞的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验（细胞毒性实验）时，还应考虑药物的吸收，可以在不含细胞、加入药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度作为空白对照。
4） 哪些物质会影响CCK-8的测定？
当有还原性物质存在时会增加CCK-8的测定，增加OD值；当有氧化性物质存在时会抑制测定反应的发生，降低OD值。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。
5） 做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？
有时会有影响。如果药物具有还原性就会和CCK-8发生显色反应，增加OD值。解决方法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度。如果它的吸光度比不含药物的培养基（只加CCK-8）的吸光度高，则说明药物有影响，可在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。
6） CCK-8对细胞的毒性大小如何？
CCK-8对细胞毒性相当低，同样的细胞在CCK-8检测后还可用于其他细胞增殖的检测实验，比如结晶紫检测法，中性红检测法或DNA荧光检测法等。由于每种细胞对CCK-8的耐受力不同，因此若需要长时间孵育，先检测下细胞在加入CCK-8后的活力。
7） 如果没有450nm的滤光片，还可以使用哪些其他滤光片？
还可使用430-490nm之间的滤光片，但450nm滤光片的检测灵敏度最高。
8） CCK-8能否对活细胞进行染色？
不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性四唑盐（WST-8），并通过电子载体1-methoxy PM将活细胞中的电子交换到培养基中的WST-8上，因WST-8及其生成的甲臢染料是高度水溶性的，不会进入细胞内，所以CCK-8不能对活细胞进行染色。
9） 必须设定参比波长？设定参比波长的目的是什么？
不一定，CCK-8在参比波长处没有吸光度。设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊产生的吸收。
10）每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？
可能存在以下几个原因：a）当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。通常情况最外一圈孔只加培养基，不作为测定孔用；b）有可能因为CCK-8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8，轻轻敲击培养板以帮助混匀；c）每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1000~100,000个/孔范围内摸索条件。
11）如果OD值太低，可以采取什么办法？
可采取2种办法：a）适当增加细胞数量；b）延长加入CCK-8后的孵育时间。
12）如果OD值太高，但不能减少细胞数量，如何解决？
可以缩短加入CCK-8后的孵育时间。比如，可以把加入CCK-8后的孵育时间由原来的3h缩短到2h。
13）CCK-8显色过程种如何终止反应？
有以下几种方法（96孔板）：a）显色反应后，将培养板置于4℃冰箱；b）每孔加10 μL0.1M的HCL溶液；c）每孔加10 μL 1% w/v SDS溶液。反应终止后请在24h内测定OD值。
14）必须预培养细胞吗？
不一定。如果需要保持细胞的最佳状态，建议预培养细胞。如果不做预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。有的科研人员不做预培养，但做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
15）预培养后，更换培养基需要细胞计数吗？
一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数板计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话，可以预培养后取培养基用血球计数板进行计数。
16）CCK-8对于不同的细胞灵敏度是否一样？
不一样。悬浮细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8后1-4h吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的染色时间或增加细胞数量来解决。
17）悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别？
悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。
18）应该每次做标准曲线吗？
建议每次都做。虽然细胞相同，但是细胞状态不一样。对于状态不一样的细胞建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能有轻微的差异，此时也建议分别做标准曲线。
19）实验之前是否需要先检测以下培养基和CCK-8之间是否有反应？
建议使用一个孔做下检测，因有时培养基种可能含氧化还原物质。正式实验之前有必要先确认下培养基和CCK-8是否有反应。一般正常的OD值应该在0.4以下。
20）有时在药物作用下，细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？
不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反应活细胞数量。如果细胞已经死亡，即使脱氢酶的活性还有，测定出来的细胞数量将会比真实值高，不能反应真实的活细胞数量，建议采用别的方法测定。
21）可否使用384孔板进行实验？
可以。向每孔加入培养基总体积10%的CCK-8。如果加入CCK-8体积太少，可以先将CCK-8稀释一倍，然后加入培养基总体积20%的量。
22）CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性？
有。但请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此，结果可能不同。
23）CCK-8能否检测细菌细胞？
可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。向每孔100μL大肠杆菌培养液中加入10μL CCK-8，培养1-4h或过夜。
24）CCK-8的稳定性如何？
CCK-8在2-8℃能稳定保存1年，推荐用此方法检测；长期不用也可置于-20℃稳定保存2年。