本公司提供可实现从 Ago 免疫沉淀到RNA纯化一系列更简便操作的「microRNA Isolation Kit」系列产品。通过使用该系列产品，可便利地从人或小鼠的细胞、组织中回收 Ago 蛋白质结合 microRNA 以及目标 mRNA。另外，从培养上清、血清、血浆中也可回收游离状态的 Ago 蛋白质结合 microRNA。回收后的 RNA 可用于定量PCR、微阵列芯片（Microarray）、新一代序列分析等各种应用。该系列产品扩充至有采用了磁珠的 MagCapture™ microRNA Isolation Kit 和采用硅珠的，共８种试剂盒。

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit（磁珠型）

　　该系列有抗人 Ago2 抗体（4G8）、抗鼠 Ago2 抗体（2D4）、抗 Ago1-4 抗体（1G3）包被磁珠的三种试剂盒以及含有可固定任意抗体的 Protein G 磁珠试剂盒，共计４款产品。这些试剂盒都采用磁珠，可更方便地进行重复性良好的免疫沉淀操作。在免疫沉淀后的纯化 RNA 步骤中，采用能获得高纯度 RNA 的离心柱法；此外，也可以采用含有抗 Ago 抗体包被磁珠的３种试剂盒的更简便的一步法。

试剂盒内容（例：Human Ago2, 10次用）

●　Anti-Human Ago2 Magnetic Beads Solution——600 μL×1支

●　Cell Lysis Solution——20 mL×1支

●　Washing Solution for IP——40 mL×1支

●　Elution Solution I for IP—— 500 μL×1支

●　Elution Solution II for IP——500 μL×1支

●　Binding Solution for Spin Column——2 mL×1支

●　Binding Enhancer for Spin Column——100 μL×1支

●　Washing Solution I for Spin Column——3 mL×1支

●　Washing Solution II for Spin Column—— 4 mL×1支

●　Elution Solution for Spin Column——1 mL×1支

●　Spin Column/Collection Tube——10支

◆概述图

产品名称	使用抗体克隆号	适应物种	对应样本	回收RNA	IP B/F 分离	RNA提纯
MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human Ago2	4G8	人、猴、狗	细胞/ 组织/血清/ 血浆	microRNA 和目标mRNA	磁力分离	离心柱法、 一步法
MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2	2D4	小鼠、大鼠、狗
MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Ago   1-4	1G3	人、猴、狗, 小鼠、大鼠		microRNA
MagCapture™ microRNA Isolation Kit,   Protein G	随意	参照抗体	细胞/组织	参照抗体		离心柱法

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human Ago2 实验案例（人）

从人细胞系中回收 microRNA

　　用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法（银染色）确认通过本产品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human Ago2）从人K562细胞（1×10⁷ cells）中获得的 microRNA（图1）。结果表明，使用本产品可获得高纯度的 microRNA。此外，通过定量 PCR 法（miR-92a 量），与使用原产品 microRNA Isolation Kit，Human Ago2 所获得的 microRNA 量相比较可知（图2），本产品的离心柱法显示与原产品几乎一样的 microRNA 回收性能；另外，在一步法中显示出了比原产品更优秀的 microRNA 回收性能。

图1. 银染色检测从人K562细胞纯化的 microRNA	图2. 人K562细胞中纯化 microRNA 回收量的比较
LaneM：标记 Lane1：合成RNA寡聚核苷酸（23base）1ng Lane2：本品（Spin Column法） Lane3：本品（One Step法）

从人血浆中回收结合游离 Ago 蛋白质的 microRNA

　　通过定量 PCR 法比较使用本产品和原产品从 200 μL 正常人混合血浆中获取的microRNA 量。结果显示，本产品的离心柱法与原产品具有几乎一样的microRNA回收性能；另外，在一步法中microRNA 回收量比原产品多。（见图３）

图３．人血浆中纯化 microRNA 回收量的比较

microRNA 的目标mRNA回收

　　向 miR-122 低表达的肝癌细胞株 HepG2 细胞（5×10⁵ cells）中导入人工合成的 miR-122 和调节用荧光素酶 siRNA（Luc siRNA），使用本产品和原产品获得配制的 Ago2 IP RNA 以及用 ISOGEN^® 配制的 total RNA。通过定量PCR法比较各RNA种所含 miR-122 的量（图４）和其目标mRNA（目标基因中 Aldo A mRNA 的量用 GAPDH mRNA 的量补充）。（图5）。结果表明，与原产品一样，通过本产品获得的目标 mRNA中，Aldo A mRNA 和 miR-122一同被浓缩，由此可知使用本产品可以获得 microRNA 的目标 mRNA。另一方面，使用 ISOGEN^® 获得的 total RNA 中，Aldo A mRNA 随着 miR-122 的增加而逐渐分解减少。

 

图4.miR-122回收量的比较

 

图5.目标mRNA回收量的比较

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2 实验案例（小鼠）

 

从小鼠细胞中回收microRNA

 

　　用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（银染色）确认通过使用本产品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2）从小鼠P388D1细胞（2×10⁷ cells）中获得的 microRNA。（图1）结果表明，使用本产品可获得高纯度的microRNA。此外，通过定量PCR法（miR-92a量），与使用原产品（microRNA Isolation Kit, Human Ago2）所获得的microRNA量相比较可知（图2），本产品的离心柱法显示与原产品几乎一样的microRNA回收性能；另外，在一步法中显示出了比原产品更优秀的microRNA回收性能。

 

图1．银染色检测从小鼠P388D1细胞纯化的microRNA LaneM：标记 Lane1：合成RNA寡聚核苷酸（23base）1ng Lane2：本品（Spin Column法） Lane3：本品（One Step法）	图2．小鼠P388D1细胞纯化microRNA回收量的比较

从大鼠血浆中回收游离Ago2蛋白质结合microRNA

　　通过定量PCR法（miR-92a量）比较使用本产品和原产品从 200 μL大鼠血浆中获取的microRNA量。结果表明，本产品的离心柱法与原产品具有几乎一样的microRNA回收性能；另外，在一步法中microRNA回收量比原产品大。（图3）

 

图3.人血浆中纯化microRNA回收量的比较

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Ago 1-4 实验案例（人）

 

回收Ago1-4结合microRNA

 

　　分别使用 Ago1, Ago2, Ago3, Ago4特异性抗体对HeLa细胞中各RNA片段免疫沉淀处理后，进行微阵列芯片（3D-Gene^® ，东丽）分析。结果表明miR-22和miR-16多数被Ago2抗体吸收。另一方面，miR-1260b, miR-4286多数被Ago1, Ago3, Ago4吸收。（表1）

　　基于此解析结果，验证使用本产品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Ago1-4），是否可回收原产品（microRNA Isolation Kit, Human Ago2）中被Ago1, Ago3, Ago4吸收较为困难的microRNA。

表1. 微阵列芯片分析结果

	信号强度				信号比
Name	Ago1   IP	Ago2   IP	Ago3   IP	Ago4   IP	Ago2/Ago1	Ago2/Ago3	Ago2/Ago4
hsa-miR-22	3521.4	21696.5	3771.2	292.4	6.16	5.75	74.20
hsa-miR-16	6886.3	28527.2	5013.4	582.5	4.14	5.69	48.97
hsa-miR-1260b	2060.3	540.9	1270.6	1977.9	0.26	0.43	0.27
hsa-miR-4286	678.8	202.4	2019.2	471.2	0.30	0.10	0.43

图1.从HeLa细胞中回收的各microRNA量的比较

从人和小鼠细胞株中回收microRNA

 

　　通过定量PCR法（miR-92a量）比较使用本产品和原产品从人K562细胞（1×10⁷ cells）和小鼠P388D1细胞（2×10⁷ cells）中获取的microRNA量。结果表明，在同等条件下，使用本产品可获得更多的microRNA。（图2、图3）

 图2.人K562细胞中纯化microRNA回收量的比较                   图3.小鼠P388D1细胞中纯化microRNA回收量的比较

 

从人和大鼠血浆中回收游离Ago结合microRNA

 

　　通过定量PCR法（miR-92a量）比较使用本产品和原产品（microRNAIsolation Kit, Human Ago2或Mouse Ago2）从人和大鼠血浆中中获取的microRNA量。结果表明，在同等条件下，使用本产品可获得更多的microRNA。（图4、图5）

     图4.人血浆中纯化microRNA回收量的比较　　　　　　            图5.大鼠血浆中纯化microRNA回收量的比较

 

从各种动物细胞株中回收microRNA

 

　　通过定量PCR法（miR-92a量）测量使用MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human Ago2、Mouse Ago2、Ago1-4从2×10⁶ cells的K562细胞（人）、COS-7细胞（猴）、MDCK细胞（狗）、P388D1细胞（小鼠）、SCC-131细胞（大鼠）中获取的免疫沉淀RNA片段中microRNA量和使用ISOGEN^®  从各种细胞中获取的total RNA片段中microRNA量。比较各免疫沉淀RNA片段中所含miR-92a 量和totalRNA片段中所含miR-92a量的相对值可知，本产品可在全部的细胞种类中获取microRNA。（图6）

 

图6.从各种细胞中获取的microRNA量的比较

 

 

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Protein G 实验案例

 

从人和小鼠细胞株中回收microRNA（与原产品的比较）

 

　　通过定量PCR法（miR-92a量）比较在使用本产品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit, ProteinG）和抗Ago1抗体（2A7）、抗人Ago2抗体（4G8）、抗人Ago3抗体（1C12）从人K562细胞（1×10⁷ cells）中获得的microRNA量以及使用原产品（microRNA Isolation Kit, Human/Mouse Ago1、Human Ago2、Human Ago3）获得的microRNA量（图1,2,3）。此外，通过定量PCR法（miR-92a量）比较在使用本产品和抗小鼠Ago2抗体（2D4）从小鼠P388D1细胞（2×10⁷ cells）中获得的microRNA量以及使用原产品（microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2）获得的microRNA量（图4）。结果表明，本产品和任意抗Ago抗体组合使用，获得的microRNA量要比原产品多。

 

从人和小鼠细胞株中回收各种Ago蛋白质结合microRNA

 

　　通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和定量PCR法（miR-92a量）研究在使用本产品和抗Ago1抗体（2A7）、抗人Ago3抗体（1C12）、抗Ago4抗体（2G7)从人K562細胞（1×10⁷cells）中获得的microRNA量（图5）。此外，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和定量PCR法（miR-92a量）研究在使用本产品和抗Ago1抗体（2A7）、抗小鼠Ago2抗体（2D4）、抗小鼠Ago3抗体（S09）、抗Ago4抗体（2G7)从小鼠P388D1细胞中获得的microRNA量（图6）。结果表明，本产品和任意抗Ago抗体组合使用，可获得各种Ago蛋白结合microRNA。

图1. 抗Ago3抗体固定时microRNA回收量的比较 本产品：使用抗Ago1抗体（2A7） 原产品：microRNA Isolation Kit, Human、Mouse Ago1 （291-70201）	图2. 人Ago2抗体固定时microRNA回收量的比较 本产品：使用抗人Ago2抗体（4G8） 原产品：microRNA Isolation Kit, Human Ago2 （292-66701）
图3. 人Ago3抗体固定时microRNA回收量的比较 本产品：使用抗人Ago3抗体（1C12） 原产品：microRNA Isolation Kit, Human Ago3 （297-70301）	图4. 小鼠Ago2抗体固定时microRNA回收量的比较 本产品：使用抗小鼠Ago2抗体（2D4） 原产品：microRNA Isolation Kit, Human、Mouse Ago2 （292-67301）

 

图5. 从人K562细胞中纯化的microRNA回收量的比较和银染色检验

 

图6. 从小鼠P388D1细胞中纯化的microRNA回收量的比较和银染色检验