Wako TRAP/ALP stain kit TRAP/ALP双重染色试剂盒使用案例
◆培养细胞TRAP/ALP酶活性染色案例
● 用TRAP染色剂使破骨细胞呈红色
● 用ALP染色剂使成骨细胞的细胞膜、软骨细胞和细胞间膜呈茶褐色
● 用核染色试剂使各种细胞核呈蓝绿色。
| RAW264细胞的TRAP活性染色
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MC 3T3-E1细胞ALP活性染色
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石蜡切片骨相关酶（TRAP，ALP）双重染色
◆实验材料及方法
材料的获取：1年龄小鼠的上、下肢骨以及脊椎骨（切除软组织）
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一次固定：4%多聚甲溶液·10%福马林溶液
二次固定：纯乙醇
部分脊椎骨的非脱钙GMA树脂包埋处理，其他部分做脱钙处理。
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脱脂、脱钙：脱钙液是ZnSO4加EDTA溶液。（与其它方法相比）
脱钙装置Histra-DC（普通光）8~16℃连续操作。
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脱水、包埋：ETP（Sakura产品）处理16小时，使用融点为58-60℃嵌入式硬石蜡包埋。
部分右上肢和腰椎脱钙GMA树脂处理。
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薄切、干燥：制作4μｍ切片，43℃伸展30分钟后，37℃干燥处理。
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染色、封装：TRAP／ALP染色试剂盒（Wako）染色，37℃干燥后，二甲苯透明处理
Malinol封装液封装
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镜检，染色性评估
◆标准标本制作
用之前使用的树脂包埋法或冷冻切片法制成的标本作为标准标本，和脱钙石蜡切片相比。即酒精固定小鼠肘关节，用乙二醇甲基丙烯酸树脂包埋，硬组织切片机制作2μｍ切片，然后进行TRAP和ALP染色（图1）。还有脱钙冷冻切片也可以作为标准标本（图2）。然后，研究或改良固定、脱钙、染色等各阶段双重染色的可行性。
图1：标准标本（GMA树脂包埋）照片是本实验标准标本——小鼠肘关节染色标本。左图为TRAP染色，右图为ALP染色。下图是二者的双重染色。染色效果均佳。以此作为阳性对照，与脱钙石蜡切片一起染色，进行染色性评估。
图2：脱钙冷冻切片酶染色—将柠檬酸脱钙的小鼠腰椎和右上肢浸泡在30%蔗糖溶液，后经OCT复合包埋，Tissue‐tekPINO冻结，Cryo制作5μｍ冷冻切片。再对切片进行酶染色。不仅可进行TRAP染色（左：红色）和ALP染色（中：褐色）的单染色，双重染色（右）也呈阳性。
固定
ALP染色使用不能用福马林固定的新鲜材料，如果未在短时间内固定，会导致酶失活，因此推荐80%乙醇固定。①小鼠膝关节不进行一次固定，直接用乙醇直接浸泡进行二次固定组。②小鼠腰椎用福马林（4％多聚甲溶液）固定16小时后再用乙醇进行二次固定。③小鼠腰椎用福马林固定4天后进行二次固定。④临床案例也用福马林固定1个月后，再进行二次固定。对上述四种类型进行TRAP·ALP双重染色，研究染色的可行性。如图3所示。本实验证明福马林固定从16小时到4天时间范围内均可进行TRAP·ALP双重染色。
图3：福马林的1次固定的固定时间和TRAP/ALP的染色性研究—①是未经福马林固定，仅用酒精2次固定的样品，ALP染色呈强阳性。TRAP染色呈阴性。②是福马林固定16小时和③是固定4天，TRAP/ALP的染色效果均佳。并且，福马林固定1个月的临床案例（骨软骨瘤）中TRAP染色呈阳性，但不能ALP染色。
脱钙
ALP酶是含有金属Zn蛋白。通过脱钙处理，酶的组成成分Zn被去除，导致酶失活。为弥补此缺点，需要添加ZnSO4，作为ALP活化剂。换言之，100mL脱钙液需添加0.4mL 1%ZnSO4，来补充Zn离子。并且，作为脱钙剂，在柠檬酸盐酸缓冲液添加Zn的同时，也可尝试添加相同螯合剂EDTA溶液进行研究。另外，也可研究酸性脱钙剂（甲酸福马林溶液）能否进行酶反应。结果显示，脱钙液添加EDTA溶液后染色良好。反之，甲酸福马林溶液不能进行酶染色。（图4）脱钙方法利用超声波脱钙装置（Histra-DC，正常光）在8~16℃的低温环境下，连续操作3-6天，对样品进行脱钙处理。脱钙后用添加甘氨酸的巴妥缓冲液（pH7.4）清洗，磷酸钙附着在组织上，防止沉淀。
图4：脱钙液的种类不同可否双重染色—左图是选用酸性脱钙溶液中对组织伤害较少的甲酸福马林
脱钙溶液脱钙3天（Histra-DC,8～16℃）后的大鼠膝关节。（Histra-DC，8-16℃）TRAP和ALP均不能染色。相对来说，中图、右图均可进行TRAP/ALP双重染色。
染色
染色法是Lorch的Gomori法。本次用的是偶氮染料法和耦合法结合的TRAP/ALP染色试剂盒（Wako，产品编号：294-67001）。对于切片的厚度，Lorch推荐8μm，同时也研究了普通的4μm切片是否能染色、双重染色的顺序应该先染TRAP和ALP中的哪一个、封片剂是否必须选水溶性封片剂等问题。
染色法结果：偶氮染料法中切片过厚导致酶扩散图像。即用TRAP染色骨质有红染倾向，但即使是4μm厚度，只要增强反应条件（反应温度和反应时间），也能充分染色的。换言之，TRAP染色中反应温度从室温调至37℃，反应时间从30分钟调至45分钟或60分钟。ALP染色在37℃反应45分钟至3小时，或者室温下翻译时间至一晚。此结果显示，两者色调平衡，染色效果好。（图5）但是，反应条件的增强导致ALP染色切片产生了很多色素颗粒（图2）。另外，TRAP和ALP的染色顺序哪一个先染色都是可以的。如果先进行ALP染色时，在TRAP阳性部位呈明显的红色，鲜艳处为破骨细胞。获得比较好的标本。但是，ALP的反应产物经过TRAP溶液处理后，会产生白色混浊颗粒，沉淀在组织上。因此，先TRAP染色，接着ALP染色的方法是可行的。封装法是利用甲基绿数秒间核染色处理。水洗后，37℃下干燥，二甲苯浸透，用马里醇(Marinol)永久封存。在浸透前用推荐使用酒精脱水，但是会产生反应产物的溶解、扩散。
图5：脱钙石蜡包埋切片的TRAP/ALP双重染色—利用1年龄小鼠腰椎的EDTA脱钙石蜡切片，进行TRAP/ALP双重染色。TRAP阳性将破骨细胞染成红色，将强细胞活性的细胞（成骨细胞、软骨细胞）染成褐色。（上：弱扩大，下：强扩大）
◆试剂盒组成
| ● 酒石酸溶液（×10）·······3 mL ● 酸性磷酸酶底物液A······30 mL ● 酸性磷酸酶底物液B······3 mL ● 核染色试剂··············10 mL ● 碱性磷酸酶预混物溶液····30 mL <备注>本产品可对应培养细胞包装24孔板-5次，96孔板-6次。 骨组织载玻片（一个载玻片约使用500 μL）包装为60个。 |
| 产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品等级 |
| 294-67001 | TRAP/ALP Stain Kit TRAP/ALP双重染色试剂盒 |
60次 | 病理研究用 |
参考文献
| 1. | Yamaguchi, S., Aoyama, T., Ito, A., Nagai, M., Iijima, H., Tajino, J., … & Kuroki, H. (2016). Effect of low-intensity pulsed ultrasound after mesenchymal stromal cell injection to treat osteochondral defects: an in vivo study. Ultrasound in medicine & biology, 42(12), 2903-2913. 全文 |
| 2. | Pang, P., Shimo, T., Takada, H., Matsumoto, K., Yoshioka, N., Ibaragi, S., & Sasaki, A. (2015). Expression pattern of sonic hedgehog signaling and calcitonin gene-related peptide in the socket healing process after tooth extraction. Biochemical and biophysical research communications, 467(1), 21-26. 全文 |
| 3. | Hatano, K., Ishida, Y., Yamaguchi, H., Hosomichi, J., Suzuki, J. I., Usumi-Fujita, R., … & Ono, T. (2018). The chemokine receptor type 4 antagonist, AMD3100, interrupts experimental tooth movement in rats. Archives of oral biology, 86, 35-39. 全文 |
| 4. | Azechi, T., Kanehira, D., Kobayashi, T., Sudo, R., Nishimura, A., Sato, F., & Wachi, H. (2013). Trichostatin A, an HDAC class I/II inhibitor, promotes Pi-induced vascular calcification via up-regulation of the expression of alkaline phosphatase. Journal of atherosclerosis and thrombosis, 15826.全文 |
| 5. | Abe, F., Takahashi, H., & Tanaka, A. (2019). Investigation on the Action and Effect of Culture Supernatant of Human Dental Pulp Stem Cells Using Rats with Medication-Related Osteonecrosis of the Jaw. Journal of Hard Tissue Biology, 28(4), 349-358.全文 |
| 6. | Kubota, M., Yanagita, M., Mori, K., Hasegawa, S., Yamashita, M., Yamada, S., … & Murakami, S. (2016). The effects of cigarette smoke condensate and nicotine on periodontal tissue in a periodontitis model mouse. PloS one, 11(5), e0155594.全文 |
| 7. | Maruyama, K., Kawagoe, T., Kondo, T., Akira, S., & Takeuchi, O. (2012). TRAF family member-associated NF-κB activator (TANK) is a negative regulator of osteoclastogenesis and bone formation. Journal of Biological Chemistry, 287(34), 29114-29124. 全文 |
| 8. | Liu, S., Kiyoi, T., Takemasa, E., & Maeyama, K. (2015). Systemic Lentivirus-Mediated Delivery of Short Hairpin RNA Targeting Calcium Release–Activated Calcium Channel 3 as Gene Therapy for Collagen-Induced Arthritis. The Journal of Immunology, 194(1), 76-83.全文 |
| 9. | Yamasaki, M., Hasegawa, S., Imai, M., Takahashi, N., & Fukui, T. (2016). High-fat diet-induced obesity stimulates ketone body utilization in osteoclasts of the mouse bone. Biochemical and biophysical research communications, 473(2), 654-661.全文 |
| 10. | Maekawa, S., Katagiri, S., Takeuchi, Y., Komazaki, R., Ohtsu, A., Udagawa, S., & Izumi, Y. (2017). Bone metabolic microarray analysis of ligature‐induced periodontitis in streptozotocin‐induced diabetic mice. Journal of periodontal research, 52(2), 233-245. 全文 |
| 11. | Maruyama, K., Uematsu, S., Kondo, T., Takeuchi, O., Martino, M. M., Kawasaki, T., & Akira, S. (2013). Strawberry notch homologue 2 regulates osteoclast fusion by enhancing the expression of DC-STAMP. Journal of Experimental Medicine, 210(10), 1947-1960. 全文 |
| 12. | Shimomura, S., Inoue, H., Arai, Y., Nakagawa, S., Fujii, Y., Kishida, T., … & Mazda, O. (2018). Treadmill Running Ameliorates Destruction of Articular Cartilage and Subchondral Bone, Not Only Synovitis, in a Rheumatoid Arthritis Rat Model. International journal of molecular sciences, 19(6), 1653.全文 |
| 13. | Yokota, J., Chosa, N., Sawada, S., Okubo, N., Takahashi, N., Hasegawa, T., … & Ishisaki, A. (2014). PDGF-induced PI3K-mediated signaling enhances the TGF‑β‑induced osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells in a TGF-β-activated MEK-dependent manner. International journal of molecular medicine, 33(3), 534-542.全文 |
| 14. | Yeom, K. H., Ariyoshi, W., Okinaga, T., Washio, A., Morotomi, T., Kitamura, C., & Nishihara, T. (2016). Platelet‐rich plasma enhances the differentiation of dental pulp progenitor cells into odontoblasts. International endodontic journal, 49(3), 271-278. 全文 |
| 15. | Saita, M., Kaneko, J., Sato, T., Takahashi, S. S., Wada-Takahashi, S., Kawamata, R., … & Nagasaki, Y. (2016). Novel antioxidative nanotherapeutics in a rat periodontitis model: Reactive oxygen species scavenging by redox injectable gel suppresses alveolar bone resorption. Biomaterials, 76, 292-301.全文 |
| 16. | Wu, Y. H., Taya, Y., Kuraji, R., Ito, H., Soeno, Y., & Numabe, Y. (2019). Dynamic microstructural changes in alveolar bone in ligature‐induced experimental periodontitis. Odontology, 1-11. 全文 |
| 17. | Li, P., Honda, Y., Arima, Y., Yasui, K., Inami, K., Nishiura, A., … & Matsumoto, N. (2016). Interferon-γ enhances the efficacy of autogenous bone grafts by inhibiting postoperative bone resorption in rat calvarial defects. Journal of prosthodontic research, 60(3), 167-176.全文 |
| 18. | Li, P., Hashimoto, Y., Honda, Y., Arima, Y., & Matsumoto, N. (2015). The effect of interferon-γ and zoledronate treatment on alpha-tricalcium phosphate/collagen sponge-mediated bone-tissue engineering. International journal of molecular sciences, 16(10), 25678-25690.全文 |
| 19. | Tezuka, R., & Tanaka, A. (2016). Jawbone Changes in Sodium Zoledronic Acid-and Dexamethasone-Treated Rats. Journal of Hard Tissue Biology, 25(4), 383-394.全文 |
| 20. | Yamada, K., Tsuji, T., & Kunieda, T. (2013). Phenotypic Characterization of Ggt1dwg/dwg Mice, a Mouse Model for Hereditary γ-GlutamylTransferase Deficiency. Experimental animals, 62(2), 151-157. 全文 |
| 21. | Fukushima, H., Shimizu, K., Watahiki, A., Hoshikawa, S., Kosho, T., Oba, D., … & Okabe, K. (2017). NOTCH2 Hajdu-Cheney mutations escape SCFFBW7-dependent proteolysis to promote osteoporosis. Molecular cell, 68(4), 645-658. 全文 |
| 22. | Kawada, S., Wada, E., Matsuda, R., & Ishii, N. (2013). Hyperbaric hyperoxia accelerates fracture healing in mice. PloS one, 8(8), e72603. 全文 |
| 23. | Ikawa, H., Moroi, A., Yoshizawa, K., Saida, Y., Hotta, A., Tsutsui, T., … & Saito, Y. (2017). Bone regeneration enhancement by ultra-violet (UV) treatment for uHA/PLLA absorbable mesh. Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery, 45(5), 634-641. 全文 |
| 24. | Sato, M., Asada, N., Kawano, Y., Wakahashi, K., Minagawa, K., Kawano, H., … & Katayama, Y. (2013). Osteocytes regulate primary lymphoid organs and fat metabolism. Cell metabolism, 18(5), 749-758. 全文 |
| 25. | Maruyama, K., Fukasaka, M., Uematsu, S., Takeuchi, O., Kondo, T., Saitoh, T., … & Akira, S. (2015). 5-Azacytidine-induced protein 2 (AZI2) regulates bone mass by fine-tuning osteoclast survival. Journal of Biological Chemistry, 290(15), 9377-9386. 全文 |
| 26. | Okuda, T., Naruo, M., Iijima, O., Igarashi, T., Katsuyama, M., Maruyama, M., … & Haseba, T. (2018). The Contribution of Alcohol Dehydrogenase 3 to the Development of Alcoholic Osteoporosis in Mice. Journal of Nippon Medical School, 85(6), 322-329. 全文 |
| 27. | Gunji, H., Kunimatsu, R., Tsuka, Y., Yoshimi, Y., Sumi, K., Awada, T., … & Yanoshita, M. (2018). Effect of high‐frequency near‐infrared diode laser irradiation on periodontal tissues during experimental tooth movement in rats. Lasers in surgery and medicine, 50(7), 772-780.全文 |
| 28. | Takano, A., Fukuda, T., Shinjo, T., Iwashita, M., Matsuzaki, E., Yamamichi, K., … & Nishimura, F. (2017). Angiopoietin-like protein 2 is a positive regulator of osteoblast differentiation. Metabolism, 69, 157-170.全文 |
| 29. | Tsuchiya, T., Sakai, A., Menuki, K., Mori, T., Takeuchi, Y., Kanoh, S., … & Nakamura, T. (2013). Disruption of aldehyde dehydrogenase 2 gene results in altered cortical bone structure and increased cortical bone mineral density in the femoral diaphysis of mice. Bone, 53(2), 358-368.全文 |
| 30. | Ishikawa, J., Takahashi, N., Matsumoto, T., Yoshioka, Y., Yamamoto, N., Nishikawa, M., … & Yamamoto, A. (2016). Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating experimental rheumatoid arthritis. Bone, 83, 210-219.全文 |
| 31. | Suzuki, K., Anada, T., Miyazaki, T., Miyatake, N., Honda, Y., Kishimoto, K. N., … & Suzuki, O. (2014). Effect of addition of hyaluronic acids on the osteoconductivity and biodegradability of synthetic octacalcium phosphate. Acta biomaterialia, 10(1), 531-543. 全文 |
| 32. | Tamura, Y., Kawao, N., Yano, M., Okada, K., Okumoto, K., Chiba, Y., … & Kaji, H. (2015). Role of plasminogen activator inhibitor-1 in glucocorticoid-induced diabetes and osteopenia in mice. Diabetes, 64(6), 2194-2206. 全文 |
◆相关产品
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| PMC-AK20-COS | Alkaline Phosphatase Staining Kit 碱性磷酸酶染色试剂盒 |
1 kit |
| PMC-AK04F-COS | TRAP Staining Kit 抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒（TRAP） |
10 plate |