NEB酶-Q5U 热启动超保真 DNA 聚合酶
产品资料 – DNA聚合酶与扩增技术 – 高保真PCR
Q5U 热启动超保真 DNA 聚合酶
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特性
- 实现重亚硫酸氢盐转化、脱氨基、或受损 DNA（例如 FFPE）的优异扩增
- 与 dUTP 和 UDG 联合使用，可防止交叉污染
- 提高 USER® 克隆的组装效率和准确性
- 基于适配体的热启动型可在室温建立扩增体系
- 针对推荐应用优化的实验方案
概述
Q5U 热启动超保真 DNA 聚合酶是 Q5® 超保真 DNA 聚合酶的改造版本，是一种新型热稳定 DNA 聚合酶，具有 3’至 5’核酸外切酶活性，并融合增强延伸性能的 Sso7d 结构域。Q5U 在尿嘧啶结合域中含有突变，能够读取和扩增含有尿嘧啶和次黄嘌呤的模板。
产品描述
许多有校对功能的聚合酶来自古细菌家族 B型 DNA 聚合酶，在遇到 DNA 模板中的尿嘧啶碱基时停止复制(Wardle, J. et al. (2008) Nucleic Acids Res. 36 (3), 705-711)。Q5U 在尿嘧啶结合域含有突变，能够读取和扩增含有尿嘧啶和次黄嘌呤的模板。该特征可用于扩增重亚硫酸氢盐转化、脱氨基、或受损 DNA，用于防止 PCR 体系中携带污染（与 dUTP 和 UDG 一起使用），以及用于 USER 克隆方法。
Q5U 是一种热启动聚合酶，含有在室温下抑制聚合酶活性的独特适配体，可在经典 PCR 条件下达到最佳扩增。
图 1：Q5U 热启动超保真 DNA 聚合酶的常见应用
古细菌家族 B 型聚合酶可以掺入/耐受多种修饰的核苷酸，但在遇到尿嘧啶和次黄嘌呤时会停止扩增。Q5U 热启动超保真 DNA 聚合酶是一种经过改造的 Q5 超保真 DNA 聚合酶，可有效地整合 dUTP 并扩增含尿嘧啶的模板。由 Q5U 热启动超保真 DNA 聚合酶的常见应用如上图所示。
图 2：Q5U 热启动超保真 DNA 聚合酶实现重亚硫酸氢盐转化 DNA 的优异扩增
使用 Q5U 热启动超保真 DNA 聚合酶（Q5U）、Phusion U 热启动 DNA 聚合酶（P）和 KAPA Hifi HotStart Uracil + ReadyMix PCR 试剂盒（K）扩增重亚硫酸氢盐转化的人基因组 DNA 靶标。扩增子名称和片段长度标注在电泳胶上方。每 25 μl 反应物含有 12 ng 重亚硫酸氢盐转化的 DNA（Qiagen）。所有反应均根据制造商的推荐使用 35 个循环进行，通过微流体芯片 LabChip 分析展现。
图 3：Q5U 热启动超保真 DNA 聚合酶能够高效扩增石蜡包埋正常肺样品 DNA
石蜡包埋正常肺样品 DNA（Biochain）。扩增片段长度标注在电泳胶上方，每个 25 μl 反应物含有 18 ng FFPE DNA（Biochain），循环条件与该样品类型的推荐一致，通过微流体芯片 LabChip 分析展现。
图 4：Q5U 热启动超保真 DNA 聚合酶能够高效扩增酶促脱氨的 DNA
使用 Q5U 热启动超保真 DNA 聚合酶（Q5U）、Phusion U 热启动 DNA 聚合酶（P）和 KAPA Hifi HotStart Uracil + ReadyMix PCR 试剂盒（K）扩增酶促脱氨（APOBEC）的基因组 DNA 靶标。扩增子名称和片段长度标注在电泳胶上方。 每个 50μl 反应物含有 12 ng 酶促脱氨基的 DNA。 所有反应均根据制造商的推荐使用 35 个循环进行，并通过微流体芯片 LabChip 分析展现。
图 5: USER® 克隆流程
在 USER 克隆中，通过 PCR 扩增出 DNA 靶分子和克隆载体，两个片段的同源序列设计为 8-12 个碱基。PCR 引物以 5’A 起始，并在同源区 3’端含有一个脱氧尿嘧啶（dU），可以设计为多片段组装，核苷酸替换，插入和/或缺失。我们建议使用 GeneDesign（http://genedesign. thruhere.net/gd/）软件为 USER 连接点设计引物。建议每种引物终浓度为 0.5 μM 即可得到最佳结果。
图 6：Q5U 热启动超保真 DNA 聚合酶与 Taq 热启动 DNA 聚合酶相比，可更高效准确的用于USER克隆
使用 Q5U 热启动超保真 DNA 聚合酶和热启动 Taq DNA 聚合酶做 USER 克隆，将 3 kb lacZ 基因连接到 pET21a 载体骨架中。菌落总数（A）和蓝色菌落的百分比（B）证明：有 Q5U 的反应展现了更高的组装效率和更高的准确度。使用 Sanger 测序进一步验证组装准确性，结果显示：普通 Taq 酶组装的 4 个蓝色克隆中有许多点突变，但使用 Q5U 的 4 个蓝色克隆中没有突变（C）。“X”表示用普通 Taq 酶产生的克隆中发现的点突变数量，与以前的研究结果同样证明了 lacZ 的高突变耐受性。(Barnes, W. M. (1992) Gene, 112, 29-35.)
随酶提供的试剂
如下试剂随该产品提供
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储存温度(℃) |
浓度 |
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Q5U™ 反应缓冲液 |
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